产CTX－M和TEM型ESBLs耐药大肠埃希菌双重PCR 检测方法的建立

陶 虹，卢体康，唐金明，廖立珊，阮周曦，刘建利，3，曾少灵，陈 兵，胡运发，孙 洁，曹琛福，张彩虹，吕建强，杨俊兴，花群义，秦智锋＊

（1.深圳出入境检验检疫局，深圳518045；2.深圳市检验检疫科学研究院，深圳518001；3.深圳市外来有害生物检测技术研发重点实验室，深圳518045）

微生物污染是影响我国食品安全最突出的因素之一。由于细菌性疾病对畜禽业造成的危害日益突出，养殖过程不断地投喂抗菌药物来预防或治疗细菌性疾病，随着抗菌药的大量使用和广泛滥用，导致耐药菌株越来越多［1］，产生β－内酰胺酶是革兰阴性杆菌重要的耐药机制之一，抗生素的滥用又导致产超广谱β－内酰胺酶（extended－spectrumβ－lactamases，ESBLs）菌株的出现。目前，产ESBLs菌株的流行日益广泛，且有不断增加的趋势。在欧洲，每年约有5 000人死于对抗生素具有耐药性的细菌感染，而近期德国等多个欧洲国家发生的耐药性大肠埃希菌污染食品及食品链致人死亡事件，致使欧盟委员会已启动其“食品与饲料快速警报系统”，以阻止这种致命的大肠埃希菌感染性疾病的蔓延。随着3代头孢菌素的广泛使用，产ESBLs细菌引起的感染越来越多，成为大肠埃希菌对新一代β－内酰胺类抗菌药物耐药的主要原因。大肠埃希菌是革兰阴性菌中最易产生耐药性的细菌［2］，而动物源性耐药质粒可通过畜禽产品的加工、食用等过程传播给人类，给食品安全和临床治疗带来困难。

目前，从猪肉和禽肉中分离到产ESBLs大肠埃希菌的报道较多，产ESBLs菌株不仅对青霉素、头孢菌素类药物表现出耐药性，而且对多种抗菌药都表现出较高的交叉耐药性和多重耐药性。根据其质粒编码的基因和酶底物的不同，ESBLs可分为TEM 型（TEMβ－lactamases）、SHV 型（SHVβ－lactamases）、CTX－M 型（CTX－M β－lactamases）、OXA型（OXAβ－lactamases）及其他型5种基因型，每种基因型又有很多亚型。不同国家和地区由于使用抗菌药物的种类和数量不同，与之相对应的ESBLs的基因型也不同［3］。其中，CTX－M 和 TEM 基因型ESBLs最常见，也是目前流行最为广泛的ESBLs基因型，且经常与其他耐药基因型混合形成“超级细菌”。

2011年德国报道，其超市中1／4的生鲜猪肉含有对多种对抗生素具有耐药性的细菌，其中主要是CTX－M基因型和TEM基因型。本研究拟通过建立能有效地针对动物产品中的含有这两种基因型的产ESBLs耐药大肠埃希菌进行特异性检测的方法并开展相关监测工作，以将耐药大肠埃希菌食品抵御至国门之外，从而增强政府对产ESBLs耐药性大肠埃希菌的有效预警和防控能力，以及应对突发公共卫生事件的能力。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细菌 不产ESBLs大肠埃希菌（ATCC25922）标准阴性菌株，购自国家微生物菌种保存中心；产CTX－M基因型ESBLs菌株和TEM基因型ESBLs菌株、产SHV基因型ESBLs菌株和产OXA基因型ESBLs菌株，由深圳出入境检验检疫局动检实验室分离并经中国动物卫生与流行病学中心鉴定；O157∶H7大肠埃希菌、沙门菌、单增李斯特菌，均由深圳检验检疫局实验室保存。

1.1.2 试剂 PCR试剂盒（QIAGEN Multiplex PCR Kit）为Qiagen公司产品；细菌DNA抽提试剂盒（EZ1DNA Tissue Kit）为 Qiagen公司产品；AST－GN13药敏卡为生物梅里埃公司产品；MH琼脂药敏用培养基为北京陆桥公司产品；头孢他啶（CAZ，30μg／片）、头孢噻肟（CTX－M，30μg／片）、氨曲南（AZT，30μg／片）、头孢曲松（CRO）、头孢他啶／克拉维酸（CAZ／clav，30μg／10μg）、头孢噻肟／克拉维酸（CTX－M／clav，30μg／10μg）药敏纸片为北京天坛药物生物技术开发公司产品。

1.1.3 仪 器 PCR 仪 （Veriti，Applied Biosystems），高速冷冻离心机 （3K15，Sigma），VITEK－2细菌鉴定系统（生物梅里埃）。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成 根据GenBank数据库中产CTX－M 型（GenBank：JX129222.1）、TEM 型（GenBank：JX129214.1）、SHV 型 （GenBank：EU376967.1）、OXA 型（GenBank：AY841859.1）ESBLs菌株ESBLs基因的核苷酸序列，利用DNA Star生物软件进行同源性分析，并参照文献筛选出耐药菌株ESBLs基因中相对保守且高度特异的核苷酸片段，设计出针对CTX－M 型和TEM 型ESBLs的通用引物。引物序列和名称见表1，引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。

表1 CTX－M型和TEM型两种基因型的引物与预期扩增片段Table 1 Primers of two gene type of ESBLs and amplification fragment

1.2.2 产ESBLs阳性菌基因组的抽提 将TEM ESBLs基因型菌株、SHV ESBLs基因型菌株、CTX－M ESBLs基因型菌株和OXA ESBLs阳性菌株接种于缓冲蛋白胨水中，混匀。36℃±1℃培养18h～24h，3 000r／min离心10min，参照 Qiagen公司EZ1核酸自动抽提工作站抽提细菌基因组方法，取菌泥抽提细菌核酸。

1.2.3 产CTX－M和TEM 基因型ESBLs大肠埃希菌双重PCR检测方法的建立 参照Qiagen公司QIAGEN Multiplex PCR Kit操作说明书配制PCR反应液：每个50μL的反应体系中包含2×QIA－GEN Multiplex PCR Master Mix 25μL，10μmol／L上游引物1μL，10μmol／L下游引物1μL，无核酸酶的水13μL，模板10μL。于ABI verity PCR仪进行PCR扩增。反应程序如下：94℃4min，94℃30s，56℃60s，72℃60s，32个循环；72℃7min。分别以TEM ESBLs基因型菌株和CTX－M ESBLs基因型菌株核酸为模板进行检测，同时将TEM ESBLs基因型菌株和CTX－M ESBLs基因型菌株混合后抽提核酸进行双重PCR检测，同时设置阴性对照。

1.2.4 PCR检测方法灵敏性试验 将TEM ES－BLs基因型菌株和CTX－M ESBLs基因型菌株进行10倍系列稀释，同时进行单重PCR检测和混合后双重PCR检测，确定所建PCR检测方法单重检测的灵敏度和双重检测的灵敏度。

1.2.5 PCR检测方法特异性试验 利用建立的检测方法对TEM ESBLs基因型菌株、SHV ESBLs基因型菌株、CTX－M ESBLs基因型菌株、OXA ESBLs基因型菌株、O157∶H7大肠埃希菌、沙门菌、单增李斯特菌等菌株进行检测，确定所建立方法的特异性。

1.2.6 冷冻畜禽肉样品的检测 为了验证所建方法的实用性，随机抽取623份冷冻畜禽肉样品进行检测。无菌操作取25g剪碎的样品（或取血样）加入到225mL缓冲蛋白胨水中进行预增菌，将预增菌液接种ChromIDESBL显色平板，36℃±1℃培养18h～24h；挑取酒红色可疑菌落，革兰染色阴性的杆菌接种血琼脂平板，36℃±1℃培养18h～24h，保存，用建立的方法进行检测。同时用VITEK－2细菌鉴定系统和NCCLSM100－S10法对样品进行检测，并将检测结果进行比较，确定所建立的方法与经典检测方法的符合率，评价其可靠性及临床实用性。

1.2.6.1 PCR筛选检测 抽提上述纯化的可疑菌株的DNA，利用建立的CTX－M和TEM两种基因型ESBLs菌株PCR快速检测方法进行检测。

1.2.6.2 VITEK－2细菌鉴定系统检测 将上述纯培养的菌株按实验要求稀释后，按照VITEK－2细菌鉴定系统操作说明书，放入VITEK－2细菌鉴定系统中同时进行生化鉴定及药敏检测。

1.2.6.3 NCCLSM100－S10分离法鉴定 对所有PCR筛选阳性和VITEK－2细菌鉴定系统鉴定为阳性的可疑菌株按照2000年NCCLSM100－S10推荐的方法进行复核确证，分离方法为：将纯培养的菌株按试验要求稀释后涂布于MH平板上，同时采用纸片扩散法初筛和双纸片试验确证。

（1）纸片筛选试验：按标准纸片扩散法的规定进行，选用 CTX－M、CAZ、ATM、CRO 4种药敏纸片做筛选试验，37℃经18h观察结果。CAZ大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌抑菌环直径≤22mm，CRO≤25mm，CTX－M 和 ATM 抑 菌 环 直 径≤27mm的细菌怀疑为产ESBLs菌株。

（2）确认试验：按标准纸片扩散法的规定进行，用CAZ和 CAZ／clav，CTX－M 和 CTX－M／clav，两组药敏纸片分别做确认试验。

（3）结果判读：含克拉维酸的药敏纸片与其相应不含克拉维酸的药敏纸片抑菌环直径的差值≥5mm，确定为产ESBLs菌株［4］。

2 结果

2.1 产CTX－M和TEM基因型ESBLs菌PCR扩增结果

在50μL反应体系中，以针对CTX－M基因型ESBLs的引物检测CTX－M基因型ESBLs菌株，可特异性扩增出544bp的目的片段；以针对TEM基因型ESBLs的引物检测TEM ESBLs基因型菌株，可特异性扩增出717bp的目的片段；将产CTX－M和TEM两种基因型ESBLs菌株引物混合，同时检测CTX－M ESBLs基因型菌株和TEM ESBLs基因型菌株混合样品，可特异性扩增出544bp和717bp的两条目的片段。对其他菌株进行PCR单重扩增和双重扩增检测时，结果全部为阴性（图1）。说明所建立的CTX－M和TEM两种基因型ESBLs菌株PCR扩增方法特异。

图1 产CTX－M和TEM两种基因型ESBLs菌株PCR检测电泳图Fig.1 PCR amplification results of CTX－M ＆ TEM gene type of ESBLs

2.2 PCR方法灵敏度试验结果

将TEM ESBLs基因型菌株和CTX－M ESBLs基因型菌株进行10倍系列稀释，于EZ1仪器上自动抽提核酸。用所建立的PCR方法，同时进行单重PCR检测和混合后双重PCR检测，进行灵敏度检测。结果显示，产CTX－M基因型ESBLs菌株PCR方法检测CTX－M ESBLs基因型菌株的灵敏度为10－5，产TEM 基因型ESBLs菌株PCR方法检测TEM ESBLs阳性菌株灵敏度为10－4，双重PCR方法检测CTX－M基因型耐药菌株灵敏度为10－4，检测TEM ESBLs基因型耐药菌株灵敏度为10－4（图2）。

图2 两种基因型PCR敏感性试验结果Fig.2 Sensitivity test results of PCR for two gene types

2.3 PCR方法特异性试验结果

用所建立的PCR方法，对TEM ESBLs基因型菌株和SHV ESBLs基因型菌株分别进行单重PCR检测，对CTX－M ESBLs菌株、OXA ESBLs菌株、O157∶H7大肠埃希菌、沙门菌、单增李斯特菌等进行双重检测，结果相应的ESBLs基因型引物只特异性地扩增出相应基因型的耐药菌株（图3），证明所建立的方法具有特异性。

2.4 冷冻畜禽肉样品的检测结果

采用本研究建立的CTX－M ESBLs和TEM ESBLs两种基因型菌株PCR检测方法，对623份冷冻畜禽肉样品进行检测。共检测出产CTX－M ESBLs基因型菌株13株，产TEM ESBLs基因型菌株1株，产CTX－M和TEM两种基因ESBLs菌株9株。

所有样品经VITEK－2细菌鉴定系统鉴定，确定可疑产ESBLs菌株为10株，经VITEK2Compact应用软件分析确定为产CTX－M基因型菌株。检测结果见表2。

图3 CTX－M和TEM两种基因型双重PCR特异性试验结果Fig.3 Specificity test results of the duplex PCR for two gene types

表2 VITEK－2细菌鉴定系统鉴定的阳性输出结果Table 2 Identification of ten E.coli from VITEK－2

采用NCCLSM100－S10推荐的纸片扩散法初筛试验和双纸片确证试验。对照菌大肠埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603的质控结果均在规定的质控允许范围内，用CTX－M、CAZ、ATM、CRO 4种药敏纸片筛选产ESBLs菌株时，若抑菌环直径CAZ≤22mm，CRO≤25mm，CTX－M≤27mm，ATM≤27mm时，为可疑产ESBLs大肠埃希菌。再用CAZ和CAZ／clav，CTX－M和CTX－M／clav组药敏纸片分别做确认试验。结果13株细菌在含克拉维酸的药敏纸片与其相应不含克拉维酸的药敏纸片抑菌环直径的差值≥5mm。因此，13株可疑阳性菌株全部为产ESBLs大肠埃希菌菌株。

3 讨论

大肠埃希菌中产ESBLs的检出率较高，其比例有逐年上升趋势。产ESBLs菌株多数对青霉素类，第1、2、3代头孢菌素，喹诺酮类，磺胺类及氨基糖苷类等抗菌药物呈多重耐药［5］。ESBLs由普通β－内酰胺酶TEM－1、TEM－2和SHV－1经个别氨基酸突变形成，由质粒介导，易在同种属甚至不同种属细菌间传递造成暴发流行。目前已发现有300多种，根据其质粒编码的基因和酶底物的不同，ESBLs基因型有TEM型、SHV型、CTX－M型、OXA型及其他型共5种，每个基因型又有很多亚型。细菌及其所受抗生素选择压力不同，其产生的ESBLs基因型、基因亚型亦不同［6］。大肠埃希菌中ESBLs以TEM基因型和CTX－M基因型为主，产PER型（PERβlactamases）、VEB 型（VEBβ－lactamases）、GES 型（GESβ－lactamases）和 BES型（BESβ－lactamases）等少见类型ESBLs菌株也在不断增加。苑丽等［1］对河南省耐药菌株普查监测表明，产ESBLs耐药大肠埃希菌占54.7%（35／64），其中38株携带 TEM基因ESBLs，19株携带CTX－M基因ESBLs，说明产TEM和CTX－M型ESBLs耐药菌株仍然是目前流行的主要耐药菌株。各个国家和地区使用的抗菌药物不同，流行的ESBLs基因型各不相同。ESBLs的传播及它们造成的多重耐药性给临床抗生素治疗造成了极大困难，及时准确检出ESBLs基因型对防止产ESBLs菌株流行、控制医院内感染和指导临床治疗有着非常重要的意义［7－8］。

鉴于TEM和CTX－M基因型耐药菌株仍然是目前耐药菌株的主要亚型，在进出口检疫中，对进口畜禽冻肉产品中耐药菌株的检测和监测就显得尤为重要和迫切。由于人为因素等原因，采用国际上通用的NCCLSM100－S10推荐方法——双纸片法进行鉴定时耗时耗力，有时会产生人为误差，易导致细菌漏检。我国尽管已经高度关注耐药菌株造成的公共卫生问题和食品安全问题，但目前尚无一种快速方便的检测方法。本研究建立的产ESBLs菌株快速检测方法为实际检测提供有效的工具。而对耐药菌株不断增加的严峻形势，有必要尽快开展相关监测工作和技术储备，以便应对国际贸易中耐药性细菌对我国食品安全的冲击。

综上所述，本研究建立了两种常见的产TEM和CTX－M基因型ESBLs大肠埃希菌的分子生物学快速检测方法，其突出的优点，一是针对性强，能有效地对产TEM和CTX－M基因型ESBLs大肠埃希菌进行特异性检测和监测；二是检测效率高，可大大缩短检测周期，提高通关速度。

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［4］ Centers for disease control and prevention.Laboratory Detection of Extended－Spectrumβ－Lactamases（ESBLs）［EB／OL］.［2013－03－01］.http：／／www.cdc.gov／hai／settings／lab／lab＿esbl.html.

［5］ 裴亚玲.鸡源大肠杆菌ESBLs基因型检测［D］.河南郑州：河南农业大学，2009.

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