STAT 3信号分子在创伤弧菌侵入树突状细胞中的作用＊

徐 妍，徐水凌

(1.遵义医学院珠海校区，广东珠海 519041;2.嘉兴学院医学院 医学微生物学与免疫学教研室，浙江 嘉兴314001)

创伤弧菌(Vibrio vulnificus，Vv)为存在于牡蛎、虾、蚌等甲壳类海产品中的嗜盐革兰阴性弧菌，可引起伤口感染、胃肠炎、肌膜炎、原发性败血症等［1－3］，具有繁殖速度快、致病力强、致死率高等特点。我们前期研究发现，创伤弧菌在感染小鼠树突状细胞(dendritic cell，DC)细胞时，可诱导DC发生凋亡，但其特殊的致病机制尚末十分清楚［4］。JAK/STAT通路具有调控细胞增殖、分化和凋亡等多种生理功能，其中的STAT3在细胞信号转导过程中起着重要作用［5－6］。创伤弧菌诱导DC凋亡时，STAT3信号分子的作用值得研究。本研究通过建立创伤弧菌(Vv 1.1758株)侵入小鼠树突状细胞(DC 2.4)的细胞模型，检测不同感染时段DC 2.4细胞的细胞凋亡率和STAT3表达情况，旨在进一步明确创伤弧菌侵入小鼠树突状细胞时STAT3信号分子的作用，为深入研究创伤弧菌的致病机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细菌株和细胞株主要试剂 创伤弧菌(V.vulnificus 1.1758)标准菌株购于中国科学院微生物研究所;小鼠树突状细胞DC2.4细胞株由浙江大学免疫研究所惠赠，以10%胎牛血清(FBS)、100U/mol青霉素和链霉素的RPMI1640培养液在37℃、5%CO2环境中培养。

1.2 主要试剂 RPMI1640细胞培养液购自美国Gibco公司;胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)购自杭州四季青生物制品有限公司;STAT3引物、GAPDH引物(由上海赛百盛基因技术公司合成);dNTP、RNase Inhibitor、DNA－marker(大连宝生物有限公司);TRIzol逆转录酶等购自美国sigma公司;Stat3(124H6)鼠单克隆抗体、p－Stat3(Ser727)单克隆抗体购自美国Cell signaling technology公司，异硫氰酸荧光素(FITC)标记的兔抗鼠IgG购自美国Sigma公司。

1.3 主要仪器 CKX31型倒置显微镜、流式细胞仪(COULTER－EPICS－XL，美国);BX51型荧光显微镜(OLYMPUS CKX41型，日本);Forma－311型CO2培养箱(Thermo，美国);680型全自动酶标仪、凝胶成像分析仪(BIO－RAD，美国);DYY－8C型电泳仪(北京六一仪器厂)。

1.4 细胞培养和V.vulnificus1.1758悬液制备小鼠DC2.4株用10%胎牛血清RPMI 1640培养液(含100U/mL青霉素和链霉素)，37℃、5%CO2的培养箱中培养，每2～3天传代1次。V.vulnificus1.1758在哥伦亚血琼脂培养基，经37℃复苏24 h，无菌状态下挑取生长良好的V.vulnificus菌落，置pH7.4浓度0.01 mmol/L的 PBS混匀，3 000 r/min离心10 min，洗3次，将其重悬于不含抗生素的RPMI1640培养液(含10%胎牛血清)，调整其细菌浓度为2.5×107CFU/mL，备用。

1.5 V.vulnificus 1.1758 与 DC2.4 细胞混合培养 取12孔细胞培养板，每孔置一盖玻片(0.8 cm ×0.8 cm)，分别接种 DC2.4 细胞(5.6 ×105个/mol)各1 mL，于37℃，5%CO2培养箱孵育24 h。吸弃培养液，每孔加入2 mL 10%胎牛血清RPMI1640培养液(不含抗生素)，分别孵育2 h。小心吸弃培养液，按细菌∶细胞(MOI)约为80∶1的比例，每孔加入V.vulnificus1.1758悬液1 mL(浓度为2.5 ×107CFU/mL)，37 ℃分别孵育 0 h，1 h，2 h，4 h，6 h和8 h，用PBS冲洗3次，取出盖玻片，以―20℃预冷的细胞固定液固定3 min，PBS洗2次，Giemsa染色、封片，光学显微镜下观察，以10%FBS RPMI1640为阴性对照，各时间段重复4个复孔。同时，于混合培养的0 h，1 h，2 h，4 h，6 h 和 8 h，去除细胞培养板上的细胞培养液，每孔加入250 uL 0.1%Triton X－100于37℃ 裂解细胞，待细胞全部裂解后每孔加入RPMI1640细胞培养液(含10%胎牛血清，无抗生素)500 μL终止裂解，混匀后每孔分别做1∶10和1∶100稀释并接种于哥伦亚血琼脂培养基，37℃恒温培养18 h，计数各时间点创伤弧菌菌落总数(CFU)，同时计算不同培养时间的细菌侵入率。细菌侵入率(%)=不同培养时间的创伤弧菌菌落总数 /培养前创伤弧菌菌落总数 ×100%。

1.6 FACS检测细胞凋亡率 收集混合培养0 h，4 h，6 h和8 h的 DC2.4细胞，PBS洗3次，分别用Annexin V FITC和Propidium iodide(PI)染色，严格按Annexin V－FITC细胞凋亡检测试剂盒操作说明书，采用流式细胞仪检测各时间段的细胞凋亡率。

1.7 RT－PCR法检测STAT3 mRAN的表达 以GAPDH为内参基因:上游引物:5’－CAAGGTCATCCATGACAACTTTG－3’，下游引物:5’－GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG －3’，目的基因片段长度554bp;STAT3引物序列:上游引物5’－GGGCTGAGAGCAGAAGGGAGCA－3’，下游引物5’－ GCCTGAAGACAGCGCTGGAGAG －3’，目的基因片段长度为337 bp。

1.7.1 逆转录合成cDNA 按逆转录试剂盒说明书操作。取经TRIzol法抽提总RNA后的0h，1 h，2 h，4 h，6 h 和 8 h 分别置于 200 μL 小 Ep 管中，每管按以下顺序加入 DEPC－treated water(RNA 模板)9μL，Control GAPDH RNA 2 μL，Random hexamer primer 1 μL，5 × Reaction Buffer 4 μL，RiolockTMRNase Inhibitor 1 μL，10 m MdNTP mix 2 μL，Revert AidTMM － Mulv Reverse Transcriptase 1μL，冰上操作，离心 10 000 rpm 1min后，置于 PCR仪中25℃ 5 min、42℃ 60 min、70℃ 5 min。总反应体系20 μL。

1.7.2 PCR反应 各组基因产物均以GAPDH基因作内参对照。采用50 μL反应体系:cDNA 3 μL，10 × Buffer 5 μL，dNTP 1.5 μL，Taq 酶0.5 μL，Mg2+3 μL，GAPDH 上、下游引物各 1.5 μL，TLR2上、下游引物各5 μL，DEPC 24 μL。反应条件:热启动94℃ 3 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 个循环后，72℃ 5 min降至4℃ 结束反应。

1.7.3 PCR扩增产物电泳鉴定 制胶:0.3 g琼脂与20 mL TBE充分溶解后加入3 μL EB混匀，制备1.5%琼脂糖凝胶。加样:各孔依次加入10 μL Mark，15 μL 0h 样品 +3 μL 6 × Loading Buffer，15 μL 1h 样品 +3 μL 6 × Loading Buffer，15 μL 2 h 样品 +3 μL 6 × Loading Buffer，15 μL 4 h 样品 +3 μL 6 × Loading Buffer，15 μL 6h 样品 +3 μL 6 × Loading Buffer，15 μL 8 h 样品 +3 μL 6 × Loading Buffer。电泳条件:U=100V，A=90mA，TBE作缓冲液电泳，电泳结束后紫外凝胶成像分析仪观察并记录结果。

1.8 免疫荧光法检测p－STAT3蛋白表达、STAT－3核转位 采用细胞爬片法，分别取0 h，1 h，2 h，4 h，6 h和8 h混合培养时间点的 DC2.4细胞片，吸出孔内液体，用自制微型盖玻片夹夹出小盖玻片，PBS轻轻冲洗3次，每片加入－20℃甲醇细胞固定10 min，去固定液，用PB5轻轻冲洗3次，沥干水分，切勿干燥。将其置于干净的载玻片上，每玻片加入40 μL p－Stat3(Ser727)单克隆抗体(用1%BSA/PBS按1∶200稀释)4℃冰箱过夜，PBS洗3次，然后用1∶100(1%BSA/PBS)稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG 30 μL于暗湿盒作用40 min，PBS轻轻冲洗5次，自然干燥，丙三醇/PBS封片，用无荧光软布擦净其背面，荧光显微镜下观察细胞p－STAT3蛋白表达。以上述相同方法检测DC2.4细胞STAT－3核转位。

1.9 统计学处理 实验数据采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，细胞侵入率以均数±标准差(±s)表示，各样本均数先进行方差齐性检验，再行单因素方差分析，两两比较采用q检验，P＜0.05表示差异值有统计学意义。

2 结果

2.1 V.vulnificus1.1758 与 DC2.4 细胞混合培养 混合培养1 h后，即有细菌侵入，侵入率为(7.8±0.8)%，培养 2 h，4 h，6 h，8 h 后，DC2.4 细胞的侵入率分别为(13.9 ±1.1)%、(34.6 ±4.9)%、(77.8 ±10.2)%和(95.8 ±13.1)%。混合培养 2 h后的细菌侵入率与培养1 h相比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)(见图1)。

图1 创伤弧菌1.1758菌株侵入DC2.4细胞(Giemsa染色，×400)

2.2 FACS检测DC2.4细胞的凋亡 流式细胞仪结合Annexin V－FITC标记法检测发现，混合培养2 h，4 h，6 h组的细胞凋亡率显著高于对照组(P＜0.05)(见图2)。

2.3 STAT3 mRNA的表达 细胞总RNA琼脂糖凝胶电泳分析表明，混合培养1h STAT3 mRNA相对表达量(79.9±13.1)%与0 h对照组(82.3±12.5)%相比，无显著性差异(P＞0.05);而混合培养2 h，4 h，6 h，8 h 后，STAT3 mRNA 相对表达量逐步降低，与0 h对照组比较，有显著差异(P＜0.05)(见图3)。

2.4 免疫荧光法检测STAT3蛋白的表达 免疫荧光法观察到随 V.vulnificus1.1758作用 DC2.4细胞时间延长，混合培养2 h后，p－STAT3蛋白表达量呈下降趋势(见图4);STAT3在混合培养2h后，也出现胞核内聚集现象(见图5)。

图5 免疫荧光技术检测小鼠DC2.4细胞STAT3核转位(×400)

3 讨论

创伤弧菌(Vibrio vulnificus，Vv)属嗜盐性革兰阴性弧菌，存在于自然界的海水环境中。人类可通过生食受创伤弧菌污染的海产品或经伤口感染进入机体内，引起严重的胃肠炎、原发性败血症、肌膜炎等［1－2］。创伤弧菌感染常发生于欧洲、美洲、亚洲等区域的沿海城市，在我国，香港、台湾、广东、浙江等地有相关病例报道［3］。自1970年，Roland首次报道创伤弧菌可引起严重的组织坏疽和急性感染性休克以来，人们开始对创伤弧菌的致病机制及特异性免疫防治等方面进行了广泛研究。由于创伤弧菌具有高致病性和高致死率的特点，其致病机制一直为人们所关注。研究表明，病原微生物诱导宿主吞噬细胞凋亡是不少病原菌感染发生、发展的重要机制，细胞凋亡的发生受多种因子调控［7－9］。DC作为机体内重要的抗原提呈细胞，在抗创伤弧菌的固有和适应性免疫中起着始动者的作用，创伤弧菌诱导树突状细胞发生凋亡时，STAT3信号分子的作用值得深入研究。本研究结果显示，V.vulnificus1.1758与 DC2.4细胞混合培养后，1h即有细菌侵入，且创伤弧菌主要以黏附或附着方式集中生长于细胞表面，DC胞内可见到中毒颗粒，细胞变圆，体积缩小;FACS检测结果显示，混合培养2h，4h，6h 后，DC2.4 细胞的凋亡率也显著高于对照组(P＜0.05)。由此我们推测:创伤弧菌在感染早期即可侵入DC2.4细胞，并诱导DC2.4细胞发生严重的凋亡，这可能是创伤弧菌感染后，病程进展快、致病力强、致死率高的原因之一。

STAT(signal transducers and activators of transcription)是一类存在于胞浆中的信号转导及转录激活因子，STAT3作为其中一个重要成员，在细胞的生长、存活、增值、分化中起重要作用［10－11］。STAT3常以非活化形式存在于胞浆中，当细胞因子配体与胞膜受体结合后引起受体二聚化，继而激活JAK蛋白，JAK蛋白使受体磷酸化，形成受体 －STAT复合物，之后JAK蛋白使STAT蛋白磷酸化，磷酸化的STAT蛋白脱离受体复合物并与同类或异类磷酸化STAT蛋白形成同型或异型二聚体，进入细胞核内引起基因表达。本研究结果还发现:DC STAT3 mRNA相对表达量随着混合培养时间的延长逐步降低，p－STAT3蛋白表达量呈下降趋势，并出现胞核内聚集现象。因此，我们推测:在V.vulnificus1.1758侵入 DC2.4细胞2h后，即可引起STAT3 mRNA的相对表达量下降及p－STAT3蛋白在胞内的表达量逐步降低，同时，STAT3出现核内转移现象，最终诱导DC发生细胞凋亡。

本研究表明，创伤弧菌可通过降低树突状细胞内STAT3 mRNA的相对表达量，抑制胞内 p－STAT3蛋白的表达，从而诱导树突状细胞凋亡，这为进一步揭示创伤弧菌的致病机制提供了实验依据。

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