猪原发性心肌症相关蛋白1基因的多态性分析

田亚光，郑 鹏，黄 贺，杨秀芹

（东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨 150030）

原发性心肌症相关蛋白1（Cardiomyopathy-as⁃sociated protein 1,CMYA1）基因最早通过mRNA差异显示技术在鸡胚的房室沟中发现，又命名为XIRP1或Xin基因[1]。利用原位杂交、Northern blot和Western blot杂交技术在mRNA和蛋白水平上研究发现，该基因是骨骼肌特异表达基因，其编码产物位于成年动物心脏闰盘的连接处，可能参与心脏闰盘的形成及维持肌原纤维的完整性[1-2]。CMYA1能够结合肌动蛋白丝，并组织微丝成网状结构[3]。小鼠Xinα基因敲除后表现为心脏肥大，超显微结构显示心脏闰盘处具有明显的分裂及肌纤维肌丝紊乱[4]。进一步研究发现Xin与细胞内信号传导和细胞骨架重塑有关[3、5]，参与BMP2-Nkx2.5-MEF2C通路来调控心脏形态变化[2-4]。Hawke等研究发现，作为一种肌动蛋白，Xin转录量在肌肉受损后的12 h急剧增加（大于16倍）[6]。因此，CMYA1与心肌和骨骼肌生长发育密切相关。

不同物种CMYA1蛋白都含有5个高度保守的结构域，分别为富含脯氨酸的区域、16个氨基酸的重复序列（又叫Xin重复序列）、DNA结合结构域、SH3结构基序和核定位信号。猪CMYA1基因由2个外显子组成，编码区全长5 420 bp，预期编码1 839个氨基酸残基的多肽链，定位在13号染色体上[7]。通过比对猪QTL数据库，发现CMYA1可能与猪平均背膘厚、第一肋骨处背膘厚、平均日增重、腿臀重以及屠宰率等性状有关。许晓玲等研究认为猪CMYA1基因与背膘厚存在显著相关[8]，但孙泰雷等在13/17罗伯逊异位杂合子猪中的研究却未得到相同结果[9]。本研究以猪CMYA1基因编码区存在的3个错义突变位点c.1394A＞G（p.His465 Arg）、c.1751A＞G（p.Asp582Gly）和 c.3290C＞A（p.Thr1097Asp）为研究对象，利用PCR-RFLP方法研究不同基因型在北京黑猪、丹系长白猪、大白猪和法系长白猪4个品种中的分布情况，为进一步揭示CMYA1基因与生长和胴体性状间关系提供依据。

1 材料与方法

1.1 组织样和DNA提取

采集191头猪的耳组织样，其中北京黑猪（39头）和法系长白猪（31头）采自黑龙江省农业科学院猪场，大白猪（53头）和丹系长白猪（68头）来自哈尔滨香坊猪场。利用酚-氯仿法提取基因组DNA[9]。

1.2 引物的设计与合成

根据GenBank提供的猪CMYA1基因mRNA序列（No.EF173403），针对3个待研究的变异位点设计引物，为后续利用PCR-RFLP方法进行变异位点检测和基因分型提供条件。引物序列及扩增条件见表1。

表1 引物序列及扩增条件Table1 Primer sequences and amplification conditions

1.3 基因型检测

PCR扩增条件：15 μL的反应体系中包括10×PCR buffer 1.5 μL、dNTPs mix 0.6 μL、上下游引物（10 μmol·L-1）各0.6 μL、rTaq DNA聚合酶 1 U、模板DNA 50 ng。反应条件为95℃预变性5 min后，95℃变性30 s，60.4℃/63℃退火30 s，72℃延伸45 s，循环33次，72℃终延伸5 min。

对不同突变位点的PCR产物分别用NcoI（c.1394A＞G）、HaeⅢ（c.1751A＞G）和RsaI（c.3290 C＞A）进行酶切。

酶切体系、反应时间及产物检测参照文献[10]进行，酶切温度按照说明书要求设置。

1.4 统计分析

使用SPSS软件进行χ2独立性和适合性检验，用PIC-Calc 0.6软件进行多态信息含量（Polymor⁃phism information content,PIC）计算。

2 结果与分析

2.1 PCR-RFLP结果统计

针对3个位点设计的引物分别成功扩增出特异性很好的PCR产物，酶切后都得到多态性条带。其中，c.1394A＞G位点的PCR产物酶切后得到514 bp、514 bp/347 bp/167 bp和347 bp/167 bp 3种带型，分别命名为AA、AB和BB基因型；c.1751A＞G位点的PCR产物酶切后得到319 bp、319 bp/212 bp/107 bp和212 bp/107 bp 3种带型，分别命名为AA、AB和BB基因型；c.3290C＞A位点的PCR产物酶切后得到286 bp、286 bp/132 bp/154 bp和132 bp/154 bp 3种带型，分别命名为AA、AB和BB基因型。各位点在不同品种中的检测结果见表2。

2.2 统计参数计算

根据PCR-RFLP统计结果，计算得到3个多态位点的纯合度、杂合度、多态信息含量等统计参数值，结果发现c.1394A＞G和c.1751A＞G都属于中度多态位点（0.24＜PIC＜0.5）（见表3）。

表3 猪CMYA1基因3个位点群体遗传学分析Table3 Statistic values of 3 polymorphic loci of pig CMYA1 gene

2.3 适合性检验

χ2适合性检验表明，在c.1394A＞G多态位点，所检测的4个群体中基因型的分布都符合Hardy-Weinberg平衡定律；在c.1751 A＞G多态位点，只有北京黑猪是Hardy-Weinberg平衡群体；在c.3290 C＞A多态位点，基因型在北京黑猪中的分布不符合Hardy-Weinberg平衡定律（见表4）。

表4 哈代-温伯格平衡检验结果Table4 Result of Hardy-Weinberg equilibrium test

2.4 独立性检验

χ2独立性检验表明在各多态位点，基因型在品种间的分布都存在显著差异（P＜0.05），各基因型在品种间分布情况的多重比较结果见表5。

表5 不同位点在各品种（系）间基因型分布的多重比较结果Table5 Multiple comparisons of individual genotypes of 3 polymorphic sites among breeds(lines)

3 讨论与结论

我国是猪肉生产和消费大国，猪肉消费量占全球一半。上世纪九十年代以前，猪遗传育种以改良生长繁育为主要目标；现阶段猪的育种目标不但追求良好的生长繁育性状，还要提高猪的抗病能力。

许晓玲等在获得杜洛克和二花脸猪背最长肌差异表达EST基础上，克隆获得CMYA1基因[8]。刘榜等在伯克夏与约克夏杂交群体中确定CMYA1基因与猪的背膘厚存在显著相关，是一个与背膘厚相关的QTL[7]。另外，CMYA1蛋白与心肌发育和形态变化有关，可以促进闰盘器的成熟和稳定，保证心脏正常功能[4]；在构建心肌肥厚和高血压动物模型中，Xin蛋白显著上调表达[11]；Julia等[12]在人类心脏组织中检测XinC蛋白表达时，发现其仅在心肌肥厚患者的样本中存在；这些都说明该基因与心血管疾病发生存在着相关性。因此，对猪CMYA1基因的研究，不但在生长和胴体性状上有潜在应用价值，也有可能与猪抗病育种相联系。

CMYA1基因在哺乳动物中高度保守，人CMYA1基因编码1 843个氨基酸，牛CMYA1基因编码1 820个氨基酸。猪CMYA1基因的核苷酸序列与人和牛相应序列相似性都为87%，氨基酸水平上的相似性则分别为83%和78%。本研究所检测的3个多态位点中，c.1394A＞G（p.His465Arg）和c.1751 A＞G（p.Asp582Gly）位点紧邻16个氨基酸的重复序列（见图1）。

图1 2个多态位点在氨基酸序列上的位置及同源性比对Fig.1 Positions and homology analysis of the 2 out of 3 polymorphic sites

16个氨基酸重复序列是肌动蛋白的结合结构域[6、13]，并参与组建细胞骨架的微丝网络[14]。此外，c.1751 A＞G（p.Asp582Gly） 在人、猪、狗、牛、猕猴、小鼠等物种中高度保守（见图1），这两个位点变异可能会对CMYA1功能产生一定影响。

c.1394A＞G（p.His465Arg）和 c.1751A＞G（p.Asp582Gly）2个点突变在大白、丹系长白、法系长白和北京黑猪中的分布存在极显著差异，并且发生频率较高（＞5%）；结合同源性和结构功能域分析结果，该突变具有作为遗传标记的潜在可能性。

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