湖北乌羊个体基因杂合度对血液生化指标的影响

姜勋平，王党伟，韩燕国，张晋玮，刘桂琼

（华中农业大学动物科技动物医学院，武汉 430070）

近年来，杂种优势在畜牧生产中得到广泛应用，目前研究主要集中于动物生长和繁殖性能方面[1]。分子标记杂合性与动物经济性状间的关联性研究已有大量报道[2-4]，但基因杂合度对动物血液影响方面研究报道较少。动物血液是机体重要的内环境，直接参与机体的新陈代谢、免疫应激等复杂的生理生化过程[5-6]。血液生化指标受遗传因素影响，从分子水平上对血液生化指标进行比较分析具有一定的探索意义，本研究用SNP标记估测个体基因杂合度，比较不同个体基因杂合度水平下血液生化指标的差异，为探索个体基因杂合度对湖北乌羊血液生化指标的影响提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

实验羊均为1.5到2周岁健康无病的湖北乌羊，共计107只，选自湖北省通山县湖北乌羊繁育基地羊群，自由放牧，夜晚补加精料，自由饮水。

1.2 血样采集及血液生化指标测定

清晨空腹颈静脉采血，使用一次性血液采集针，采集血液7 mL分两管，其中4 mL置于37℃水浴自然凝血后，3 500 r·min-1离心分离出血清，立即带回实验室在12 h内完成各项生化指标的测定，3 mL血液按照文献[7]提取DNA。

用罗氏P800全自动生化分析仪MODULAR-PE（瑞士）对如下生化指标进行测定：谷丙转氨酶（Al⁃anine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（Aspar⁃tate aminotransferase，AST）、碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）、总蛋白（Total protein，TP）、白 蛋 白（Albumin，ALB）、 球 蛋 白（Globulin，GLOB）、总胆固醇（Total cholesterol，TC）、甘油三酯（Triglycerides，TG）、磷酸肌酸激酶（Creatine ki⁃nase，CK）、乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase，LDH）。其中，ALP，CK与LDH使用上海罗氏制药有限公司试剂盒测定；ALT、ALP，TG和TC使用中生北控生物科技股份有限公司的试剂盒测定；TP，GLOB使用长春汇力生物技术有限公司的试剂盒测定，具体操作方法按照相应试剂盒推荐的程序完成。

1.3 SNP的筛选及基因分型结果

1.3.1 SNP引物信息

根据已发表文献中的研究成果及本实验室的积累，收集整理SNP位点，在湖北乌羊群体中进行扫描并基因分型，由于某些标记可能与湖北乌羊血液生化指标存在相关，因此先统计分析各标记基因型间是否存在差异，如果有则弃之，最终选取13个SNP标记（见表1）来对湖北乌羊进行杂合度进行统计。

表1 13个SNP的相关信息Table1 Informmation of 13 SNP sites

1.3.2 基因分型结果

本试验所选的13个SNP标记位点之中，8个采用PCR-SSCP分型，6个采取PCR-RFLP分型，现各选取两个PCR-SSCP分型位点和两个PCR-RFLP分型位点结果作为代表。如图1所示，图1为IGF-Ⅰ基因部分扩增片段，其长度为363 bp，利用HaeⅢ内切酶酶切后琼脂糖凝胶电泳呈现3种基因型，3条带的为363 bp-264 bp-99 bp杂合子个体；图2为Mc1R基因部分扩增片段，其长度为167bp，利用HaeⅢ内切酶酶切后琼脂糖凝胶电泳呈现三种基因型，3条带的为167 bp-121 bp-46 bp杂合子个体；图3、图4分别为Myf5和INHβA基因部分扩增片段，其中PCR-SSCP电泳图中3条带的均为杂合子个体。

图1 IGF-1基因多态位点琼脂糖及PCR-RFLP电泳图Fig.1 Mutation of IGF-1:Agarose gel electrophoresis of the PCR product of Primer IGF-1 and PCR-RFLP results

图2 Mc1R基因多态位点琼脂糖及PCR-RFLP电泳图Fig.2 Mutation of Mc1R:Agarose gel electrophoresis of the PCR product of Primer Mc1R and PCR-RFLP results

图3 Myf5基因多态位点琼脂糖及PCR-SSCP电泳图Fig.3 Mutation of Myf5:Agarose gel electrophoresis of the PCR product of PrimerMyf5and PCR-SSCP results

图4 INHβA基因多态位点琼脂糖及PCR-SSCP电泳图Fig.4 Mutation of INHβA:Agarose gel electrophoresis of the PCR product of PrimerINHβAand PCR-SSCP results

1.4 统计方法

个体基因杂合度Hi的计算：假设n是山羊基因组内所有基因座的取样，在取样的n个基因座位中，杂合座位数Hl与取样座位数n的比值Hi就是个体基因杂合度，其反映一个个体的基因杂合程度[12]。计算公式如下:

按照个体基因杂合度以0.15为步长，将107只湖北乌羊分为4个杂合度水平，用SAS（V8.1）统计软件对不同杂合度水平与湖北乌羊的血液生化指标进行比较分析。

2 结果与分析

2.1 SNP基因杂合度

由13个SNP标记计算出的基因杂合度范围在0.1538～0.6154，分为4个水平，结果见表2。表中平均观察杂合度较低主要原因是在某些座位上，个体以纯合子为主。

2.2 个体基因杂合度对湖北乌羊血液生化指标的影响

不同杂合度水平下血液生化指标的差异分析见表3，由表可见基因杂合度水平只对所测血液生化指标中的CK具有显著影响（P＜0.05），其他血液生化指标在4个杂合度水平下均无显著差异（P＞0.05）。杂合度水平为1（平均杂合度为0.2028）时，血液生化指标CK含量较高平均为306.22 U·L-1，杂合度水平为3（平均杂合度为0.4615）时，血液生化指标CK含量较低平均为234.52 U·L-1。

表2 个体基因杂合度Table2 Individual gene heterozygosity range for four levels

表3 各个体基因杂合度水平下湖北乌羊的血液生化指标Table3 Hubei Black-boned goat blood biochemical parameters at 4 levels for individual gene heterozygocity

3 讨论与结论

机体通过血液循环将营养物质运送到各组织细胞中，从而发挥营养调控作用以及一系列复杂的生化反应，因此血液生化指标某种程度上可以间接反应机体的健康状况、应激和免疫能力。

本研究发现湖北乌羊血清中CK含量与个体基因杂合度之间存在倒钟形曲线关系，CK含量先随个体基因杂合度增加逐渐降低，在杂合度水平3（0.38～0.54）时，CK含量达到最低值，此时随群体杂合度增加时CK水平反而会升高。多重比较表明杂合度水平1与杂合度水平3之间差异显著（P＜0.05）；CK水平可以反映动物的应激，CK活性高则表示动物受到刺激时大量表达，表明该动物抗应激能力较弱[14-16]。本研究发现湖北乌羊的最适杂合度水平0.38＜hi≤0.53，说明此杂合度下湖北乌羊的抗应激能力可能较强。

除CK外，LDH是另一个与抗应激相关的指标。研究表明个体LDH水平越高，肌肉代谢水平越高，意味着动物抗应激能力越弱[13-14]。本研究中不同杂合度水平下湖北乌羊血清中LDH含量差异不显著，但是杂合度水平3 LDH含量（352.12 U·L-1）略低于杂合度水平1（373.45 U·L-1），这与CK含量在杂合度水平1与杂合度水平3之间的变化趋势相一致，CK含量低，LDH含量也相对较低，个体的抗应激能力相对较强。

GB是体液免疫的主要成分，其含量反映机体抗病能力。本研究中GB含量随着杂合度的增加先升高后降低，在杂合度水平3时最高，更进一步揭示在杂合度水平3的情况下，湖北乌羊的抗应激能力可能最好，在选种过程中湖北乌羊个体基因杂合度最好控制在0.38～0.54水平，此杂合度水平下可能有利于提高湖北乌羊种群的抗应激能力使得适应性增强。

一般认为高杂合度与近交衰退呈负相关，与杂种优势呈正相关，但基因杂合度与机体性状间不是简单的相关关系[15]。根据不同杂合度水平分析，不同性状的适当基因杂合度才能保证其最优的含量水平或生产能力。

[1]Cam M A,Olfaz M,Soydan E.Body measurements reflect body weights and carcass yields in karayaka sheep[J].AsianJournal of Animal and Veterinary Advances,2010,5(2):120-127.

[2]Lee M,Godshalk E B,Lamkey K R.Association of restricton frag⁃ment length polymorphisms among maize inbred with agronomic performance of their crosses[J]Crop Science,1989,29:1067-1071.

[3]Dudley J W,Saghai M A,Rufener G K.Molecular marker informa⁃tion and grouping of parents in corn breeding programs[J].Crop Science,1991,31:718-723.

[4]吴晓林,李栒,Merete Fredholm.连续杂交下家猪微卫星基因杂合度与经济性状的相关性研究[J].遗传学报,2001,28(1):20-28.

[5]王勇,张才骏,卢福山.欧拉羊的血红蛋白多态性及其与血液指标的联系[J].青海大学学报,2007(4):61-63.

[6]刘湘帆,王学峰,樊绮诗.联合多个微卫星DNA位点进行血友病B基因诊断[J].中华血液学杂志,2002,23(3):147-150.

[7]萨姆布鲁克J,弗里奇E F,曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南[M].金冬雁,黎孟枫,译.北京:科学出版社,1992.

[8]王凭青,鲁浪,储明星.孕酮受体多态性及其与济宁青山羊产羔数关系[J].中国农业科学,2009,42(5):1768-1775.

[9]孙瑞平,王利心,王建刚.山羊LHβ基因多态性与产羔数的相关分析[J].西北农林科大学学报,2009(6):53-55.

[10]张海军,陈宏,房兴唐.山羊MyoD基因家族多态性及与体尺性状的相关性[J].遗传,2007,29(9):1077-1082.

[11]Liu W J,Fang G X,FangY.The Polymorphism of a Mutation of IGF-1 Gene on Two Goat Breeds in China[J].Journal of Animal and Veterinary Advances.2010,9(4):790-794.

[12]姜勋平,熊远著,刘桂琼.猪个体基因杂合度对生产形状的影响[J].遗传学报,2003,30(5):431-436.

[13]Suchint S,Orawan C,Worapol A.Hematological,electrolyte and serum biochemical values of the Thai indigenous chickens(Gallus domesticus)in northeastern Thailand,Songklanakarin[J].J.Sci.Technol.2004,26(3):425-430

[14]DamirŽubcic.Some biochemical parameters in the blood of graz⁃ing German improved fawn goats from Istria,Croatia[J].Veterinar⁃ski Arhiv,2001,71(5):237-244.

[15]刘国庆,孙业良,杨利国.级进杂交绵羊微卫星基因杂合度与生长性能的关系[J].南京农业大学学报,2006,29(1):67-71.