不同锌源对肉鸡组织锌含量、酶活性、金属硫蛋白含量及其基因相对表达量的影响

刘化伟，刘大森，郑立鑫，石汝彬

（东北农业大学动物营养研究所，哈尔滨 150030）

锌是机体必需的微量元素，参与机体300多种酶和功能蛋白的组成，对动物的生长与发育具有重要作用[1-2]。目前，在饲料中常用的锌源主要包括无机锌和氨基酸螯合锌两类，但针对氨基酸螯合锌和无机锌在吸收利用率上的研究结果各不相同。相关研究在不同动物试验中指出氨基酸螯合锌的吸收利用率优于无机锌[3-6]。Hill和Pimentel等分别在猪和肉鸡的试验中指出氨基酸螯合锌和无机锌在吸收利用率上无显著差异[7-8]。造成氨基酸螯合锌吸收效果不同的主要原因是没有考虑饲料复杂因素干扰、试验动物的不同、产品质量的差异和吸收机制不明确等原因，且研究多集中于蛋氨酸锌与硫酸锌间比较，对于多种锌源间的比较研究则相对较少。因此，本试验选择市场常见的2种氨基酸螯合锌与2种无机锌，通过饲喂相同水平不同锌源的半纯合饲粮，排除饲粮因素干扰，研究氨基酸螯合锌对肉鸡血液和组织中锌含量、肝脏和胰脏金属硫蛋白（Metallothionein,MT）含量、肝脏相关酶活性及十二指肠黏膜金属硫蛋白基因相对表达的影响。比较4种锌源在AA肉仔鸡中的作用效果，为肉仔鸡锌添加剂在生产实践中的选择和应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验选用2种无机锌：硫酸锌（ZnSO4·7H2O，购自天津博迪化工有限公司），其中ZnSO4含量不小于99.50%、锌含量40.03%；氧化锌（ZnO，购自天津基准化学试剂有限公司），ZnO含量不小于99.00%、锌含量80.33%。2种氨基酸螯合锌：蛋氨酸锌（ZnMet），ZnMet含量不小于79.00%、锌含量17.50%；赖氨酸锌（ZnLys），ZnLys含量不小于58.00%、锌含量10.50%。2种螯合锌均由广东天科有限公司提供。

1.2 设计

试验选100只1日龄AA肉公鸡，采用单因子完全随机设计，共设4个处理组，分别为：氧化锌组、硫酸锌组、赖氨酸锌组、蛋氨酸锌组。每组5个重复，每个重复5只鸡。肉鸡在1～13日龄期间饲喂含饲料级一水硫酸锌的玉米-豆粕型饲粮（锌含量100 mg·kg-1）保证仔鸡健康成长。14～21日龄饲喂缺锌玉米-豆粕日粮（锌含量22.61 mg·kg-1），使肉仔鸡临界缺锌状态，以提高肉仔鸡对不同形态锌吸收的敏感性，1～21日龄自由采食和饮水。22～28日龄饲喂充足含不同锌源的4种半纯合日粮（锌含量90 mg·kg-1），22～28日龄自由采食和饮用去离子水，24 h恒定光照。1～28日龄日粮见表1。参照美国NRC（1994）[9]肉仔鸡的营养需要量配制 基础饲粮。饲养管理按《AA肉仔鸡饲养管理手册》进行。

1.3 样品采集与制备

试验结束，从各组每个重复选1只鸡，翅静脉采血10 mL左右于肝素钠管中，3 000 r·min-1离心10 min，分离血清，贮存于1.5 mL EP管中-20℃保存待分析用。采血后将肉鸡颈部放血，剥皮，快速解剖分离肝脏、胰腺、胸肌、腿肌及胫骨，各组织分别放入液氮速冻后于-80℃保存待测。取十二指肠肠段，外翻后，用冰的灭菌生理盐水冲洗，再用灭菌的载玻片刮下十二指肠的小肠粘膜，将其置于灭菌的1.5 mL的离心管中，液氮冻存，以备检测MT mRNA的相对表达量。

表1 基础日粮组成及营养水平Table1 Composition and nutrients level of basal diet(%)

1.4 测定指标与方法

1.4.1 血液及组织锌含量测定

试验中所用玻璃器皿提前用5%硝酸浸泡去除离子干扰。胫骨先用去离子水冲洗干净，然后煮沸，剥除外层附着物，再用去离子水冲洗后于600℃下灰化至恒重备用。组织处理采用湿灰化法，称取1 g肝、胰或胫骨，分别加入5 mL混合酸（浓硝酸∶高氯酸=4∶1），消化过夜后盖上表面皿，置于电热板上消煮至澄清透明，待冷却后用超纯水定容至100 mL容量瓶中。取1 mL血清，加入5 mL混合酸，消煮后定容至50 mL。用火焰原子吸收光谱仪（仪器型号TAS-986、工作站版本AAWin V1.2）测定样品锌含量，锌标准溶液购于国家标准物质中心。

1.4.2 组织MT含量测定

用镉血红蛋白亲和力分析方法[10]测定肝脏、胰腺中MT含量，测定用牛血红蛋白购自Sigma公司，镉标准液由国家标准物质中心提供，使用仪器为火焰原子吸收光谱仪。

1.4.3 肝脏酶活性的测定

肝脏中碱性磷酸酶、铜锌超氧化物歧化酶、谷草转氨酶、谷丙转氨酶和乳酸脱氢酶活性均由南京建成提供的试剂盒测定，具体操作步骤按说明书进行。

1.4.4 十二指肠黏膜MT mRNA表达量测定

按照RNA提取试剂盒说明书（百泰克公司）抽提总RNA，利用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量和浓度（OD260/280=1.8-2.0）。检测后的总RNA立即进行反转录，-80℃冰箱中保存待用。

根据GenBank中检索到的肉鸡看家基因β-actin和MT基因序列（NM_205518）、（NM_205275）设计引物，β-actin上游引物：5'GAGAAATTGTGCG TGACATCA 3'，下游引物:5'CCTGAACCTCTCAT TGCCA 3'。MT上游引物：5'ACTTGTGCTGCT GGTGACTC 3'，下游引物：5'GCTTTTCGTGG TCCCTGTC 3'。引物均由上海生物工程有限公司合成。

RNA反转录反应使用High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits（Applied Biosystems）试剂盒，采用20 μL反应体系，进行反转录。

real-Time PCR反应按照大连宝生物公司的SYBR real-Time PCR Kit试剂盒进行。反应体系为：SYBR®Premix Ex TaqTM（2×）10.0 μL，PCR Forward Primer（10 μmol·L-1）0.4 μL，PCR Reverse Primer（10 μmol·L-1）0.4 μL，ROX Reference Dye II（50×）0.4 μL，d H2O（灭菌蒸馏水）6.8 μL，cDNA模板2 μL，共20 μL。将目的基因和看家基因在同一板中进行反应（见表2），采用2-△ct进行相对定量。

表2 实时荧光定量PCR反应的程序设置Table2 Program settings of Real-time fluorescent quantitative PCR

1.4 数据处理

试验数据用SAS9.13软件进行方差分析和多重比较，结果以平均值±标准误表示，以P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同锌源对血液和其它组织锌含量的影响

不同锌源对肉鸡血液和组织锌含量影响见表3。

氨基酸螯合锌（ZnMet、ZnLys）处理组血液、肝脏和胫骨锌含量显著高于无机锌（ZnSO4、ZnO）处理组（P ＜0.05），各无机锌（ZnSO4、ZnO）处理组和氨基酸螯合锌（ZnMet、ZnLys）处理组之间无显著差异（P＞0.05）。不同锌源处理组对胰脏、胸肌和腿肌影响不大，无显著差异（P＞0.05）。

表3 不同锌源对血液和其他组织锌含量的影响Table3 Effects of different Zn source on broiler'blood Zn and other organization Zn concentration

2.2 不同锌源对肝脏和胰脏金属硫蛋白含量的影响

不同锌源对肉鸡肝脏、胰脏金属硫蛋白含量影响见表4。氨基酸螯合锌（ZnMet和ZnLys）处理组和无机锌（ZnSO4、ZnO）处理组对肝脏和胰脏金属硫蛋白影响不大，并无显著差异（P＞0.05）。

2.3 不同锌源对肝脏酶活性的影响

不同锌源对肉鸡肝脏酶活性影响见表5。

氨基酸螯合锌（ZnMet、ZnLys）处理组肝脏中的铜锌超氧化物歧化酶活性较无机锌（ZnSO4、ZnO）处理组显著升高（P＜0.05），但在各氨基酸螯合锌和无机锌处理组间无显著差异（P＞0.05）。不同锌源对肝脏中碱性磷酸酶、谷草转氨酶、谷丙转氨酶和乳酸脱氢酶影响无显著差异（P＞0.05）。

2.4 不同锌源对十二指肠黏膜MT mRNA相对表达量的影响

不同锌源对肉鸡十二指肠黏膜MT mRNA相对表达量影响见表6。

表4 不同锌源对肉鸡肝脏和胰脏金属硫蛋白含量的影响Table4 Effects of different Zn source on broiler'liver,pancrease MT and concentration

表5 不同锌源对肝脏酶活性的影响Table5 Effects of different Zn sources on enzymes activity of liver in broilers

表6 不同锌源对肉鸡十二指肠黏膜MT mRNA相对表达量的影响Table6 Effects of different Zn source on broiler'MT mRNA expression of duodenal mucosa

氨基酸螯合锌（ZnMet、ZnLys）处理组对肉鸡十二指肠肠黏膜MT mRNA相对表达量较无机锌（ZnSO4、ZnO）处理组显著升高（P＜0.05）。但在各氨基酸螯合锌（ZnMet、ZnLys）处理组和无机锌（Zn⁃SO4、ZnO）处理组之间的MT mRNA相对表达量无显著差异（P＞0.05）。

3 讨论与结论

3.1 不同锌源对肝脏和胰脏金属硫蛋白含量及十二指肠黏膜MT mRNA相对表达量的影响

金属硫蛋白是一类小分子质量富含半胱氨酸（33%）的金属结合蛋白。MT特点是可以高亲和力与锌和其他重金属结合，每分子MT可结合7原子锌[11-12]。在鸡组织中仅存在1种MT，这种形式的MT已被证明存在于鸡的肝、胰、肾和小肠黏膜中[13]。当外界环境锌浓度较高时，MT表达增加，可结合并储存锌，缺锌时，MT表达减少。日粮锌的摄入直接反映组织中金属硫蛋白合成[14]。在体液和组织中MT是反映不同锌源吸收率敏感指标[15]。Rojas等研究发现，赖氨酸锌处理组显著提高羊的肝脏、肾脏、胰脏金属硫蛋白含量[16]。Reeves等报道，给大鼠饲喂高锌饲粮，肝脏MT显著增加[17]。Fleet等通过注射或口饲补锌24 h内，雏鸡肝和胰MT明显增加[18]。

本试验亦发现，氨基酸螯合锌处理对肝脏和胰脏中金属硫蛋白浓度虽未显著高于无机锌组，但有升高趋势。Levenson等研究发现，给大鼠饲喂含锌1、30及180 mg·kg-1饲粮16 d后，其回肠MT mRNA水平随饲粮锌水平增加而显著增加[19]。于昱研究结果表明，不同络合强度有机锌与无机锌相比，可以增加十二指肠黏膜MT基因相对表达量[20]。本试验研究结果与上述报道一致，氨基酸螯合锌（ZnMet、ZnLys）处理组肉鸡十二指肠黏膜MT mRNA相对表达量显著高于无机锌（ZnSO4、ZnO）处理组，符合氨基酸螯合锌的竞争吸收假说，即氨基酸螯合锌可避免肠腔中沉淀剂对矿物元素的沉淀或吸附作用，直接到达小肠刷状缘，在吸收位点处发生水解，锌以离子形式进入肠上皮细胞。

3.2 不同锌源对血液和其他组织锌含量的影响

机体血液和组织锌浓度作为反映锌在机体吸收利用率的敏感指标已经被证实[21]。根据不同锌源和不同锌水平代谢利用上的差异，各组织器官对进食锌的反应敏感性也不同。李杰研究报道，在10～50 mg·kg-1锌条件下，肝脏、胫骨锌对饲粮锌水平的变化均较敏感，均是评价饲粮锌的良好指标[22]。Ao等报道，饲喂氨基酸螯合锌饲粮组较硫酸锌组能显著提高肉鸡肝脏锌含量[23]。Wedekind等研究发现，在肉鸡中饲喂蛋氨酸锌组中胫骨锌含量显著高于氧化锌和硫酸锌组[24]。Schell等研究表明，给猪饲喂含2 000 mg Zn/kg的蛋氨酸锌的饲粮组肝脏和血液锌含量显著高于氧化锌组[25]。Hahn等报道，饲喂3 000 mg Zn/kg，蛋氨酸组血液中锌含量显著高于硫酸锌组[26]。Salim等研究表明，在肉鸡日粮中额外添加25 mg Zn/kg的有机锌和无机锌，有机锌组血液中锌含量显著增加[27]。本试验证实，氨基酸螯合锌（ZnMet、ZnLys）处理组血液、肝脏和胫骨锌含量显著高于无机锌（ZnSO4、ZnO）处理组，与前人研究结果一致。

3.3 不同锌源对肝脏酶活性的影响

锌参与机体300多种酶和功能蛋白的组成，在动物体内主要通过酶或功能蛋白而参与一系列重要生化反应。在本试验中，不同锌源对肝脏中碱性磷酸酶、谷草转氨酶、谷丙转氨酶和乳酸脱氢酶并无显著影响，说明饲喂的锌含量足以满足这4种酶的活性，并且这4种酶不是反映锌吸收的敏感指标，与Yuan等研究结果[28]一致。锌是铜锌超氧化物歧化酶结构和功能的重要组成部分以及酶的激活剂，分布极为广泛，约占到总超氧化物歧化酶的90%[29]。因此，铜锌超氧化物歧化酶可以作为在体内评价锌吸收的生物参数[30]。Coudray等在人和大鼠上采用体内和体外实验相结合证明锌可以调节Cu/Zn-SOD活力，认为Cu/Zn-SOD活力可以反映机体的锌营养状况[31]。曹国华等在小鼠上的研究结果则表明缺锌会导致肝脏Cu/Zn-SOD活力降低，补锌(50 mg·kg-1)以后可以得到恢复[32]。本试验研究发现，氨基酸螯合锌处理组肝脏中铜锌超氧化物歧化酶活性显著高于无机锌组，与前人研究结果一致。

本试验结果表明，氨基酸螯合锌能显著提高肉鸡血液、肝脏和胫骨锌含量，提高铜锌超氧化物歧化酶活性，调控十二指肠黏膜金属硫蛋白基因表达。

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