脐带间充质干细胞在遗传性痉挛性截瘫中的应用

刘静 韩冬梅 王志东 郑晓丽 丁丽 朱玲 薛梅 阎洪敏 郭子宽 王恒湘

遗传性痉挛性截瘫（HSP）是一组以对称性双下肢进行性肌无力和肌张力增高为主要表现的遗传性神经变性疾病。病情进行性进展，最后丧失自主生活能力，既往缺乏有效治疗措施，预后差。脐带间充质干细胞（UC-MSC）来源于脐带，易于获取，体外能够大量扩增，低免疫原性，具有横向分化的潜能，在适当的条件下可向外胚层的神经细胞分化。我们采用UC-MSC鞘内注射治疗一家系父子2人HSP复杂型，取得一定疗效，现报道如下。

1 病例资料

1.1 患者资料

子，17岁，为先证者。于2006年开始出现行走不稳、四肢僵硬，双手姿势异常伴活动不利，言语不清楚，症状逐渐加重。2010年2月，颅脑MRI示小脑轻度萎缩；肌电图检查示左侧正中、尺神经运动神经M波潜伏期稍延长，下波100%，sev正常，左侧大小鱼际肌、胸锁乳突肌、双侧胫前肌及胸10～11脊旁肌未见自发电位，MUAP稍宽大；X线提示双手无明显骨关节病变；查铜兰蛋白正常。经北京市神经肌肉病协会会诊中心会诊（编号1938），诊断为HSP复杂型。2009年9月来我院就诊，入院查体：意识清楚，语言不清、欠流利。四肢肌力正常，四肢肌张力明显升高，双手尤著，致手指运动受限，双手拇指及食指外展明显受限。痉挛性剪刀步态，行走不稳，易摔跤，步速减慢，不能走直线，不能跑跳，不能单腿站立，自然站立时足距明显增大（25～35 cm），闭目难立征阳性（睁、闭眼明显晃动）。双侧指鼻试验、指指试验、轮替试验、跟膝胫试验正常。双眼凝视时有短暂眼震，眼球追踪检查者手指时有轻度跳跃，双眼扫视无辨距不良。肱二头肌腱反射（++），肱三头肌腱反射（++），桡骨膜反射（++），膝腱反射（++++），跟腱反射（++++）。 膑、踝阵挛(+)。 诊断：HSP（复杂型）。

父，40岁，于2000年开始出现四肢僵硬，走路、站立不稳，言语不清楚，呈进行性加重，偶有饮水呛咳。头颅MRI显示小脑萎缩。2009年9月来我院，入院查体：意识清楚，口齿略不清、欠流利，四肢肌力正常，四肢肌张力明显升高，双下肢尤著。行走呈剪刀步态，行走摇晃、缓慢，转身困难，不能走直线，不能跑跳，不能单腿站立，自然站立时足距轻度增大（10～25 cm），闭目难立征阳性（睁、闭眼立即摔倒）。双侧指鼻试验、指指试验欠稳准，无意向性震颤，双侧轮替试验、跟膝胫试验正常。双眼凝视时有短暂眼震，眼球追踪检查者手指时有轻度跳跃，双眼扫视无辨距不良。双侧肱二头肌腱反射（++），肱三头肌腱反射（++），桡骨膜反射（++），膝腱反射（++++），跟腱反射（++++），膑阵挛（-），踝阵挛（+）。 具有家族遗传病史。 诊断：HSP（复杂型）。

告知患者治疗风险，签署知情同意书，治疗方案经医院医学伦理委员会批准。两患者均具有干细胞治疗适应证：无发热、感染，无凝血功能及心、肺、肝、肾等重要脏器功能障碍。

1.2 家系调查

该家系4代共有5人发病，本报道中子系第4代患者，为先证者（图1）。

图1 遗传性痉挛性截瘫家系图谱（→：先证者）Fig.1 Pedigree of a family with HSP(allow:propositus)

2 方法

2.1 UC-MSC的制备

[1]方法，稍加改良后进行UC-MSC制备。即，经知情同意及感染源检测后收集脐带，去除外膜和动静脉，将脐带剪成0.5 cm3大小的组织块，加入等体积0.2%Ⅰ型胶原酶，37℃消化过夜。次日加入2倍体积的0.05%的胰蛋白酶，37℃消化1 h。2 000 r/min离心10 min收集细胞，计活细胞数。将细胞悬浮于hMSC无血清培养基中，按106cells/cm2底面积接种于塑料培养瓶中。1周后出现由数十个形态类似于成纤维细胞组成的集落。加入0.05%胰蛋白酶消化，并按6 000 cells/cm2底面积进行传代培养。利用流式细胞测定细胞表型，常规感染源检测后，收集细胞用于治疗。或收获细胞置于-80℃冰箱冻存备用，用前在37℃环境下快速复苏，24～48 h培养，收获贴壁生长的细胞供临床应用。

2.2 UC-MSC注射

入院第3或第4天开始给患者行腰椎穿刺，鞘内注射UC-MSC，1次/周，4次为1个疗程。常规腰穿，将 UC-MSC 10 mL（每次 1×106cells/kg）+地塞米松5 mg在10 min内缓慢注入蛛网膜下腔，拔针，敷以无菌辅料，嘱患者去枕平卧6 h。两患者于2009年9月接受第1疗程治疗，于2010年4月接受第2疗程治疗。

2.3 辅助治疗

进行常规系统康复锻炼。

2.4 评估标准

采用改良Ashworth肌张力分级标准 （MAS）[2]、世界神经病联合会国际合作共济失调评分量表（ICARS）[3]及日常生活量表（ADL），对患者治疗前及治疗后1个月的神经功能及生活质量进行评定，MAS（分 0、1、1+、2、3、4 级，0 级为正常）越高、ICARS及ADL分值越高表示神经功能缺损越严重。

2.5 不良反应及并发症观察

观察治疗中及治疗后有无发热、腰痛、头痛、头晕等不良反应。

3 结果

末次治疗结束后随访20个月，每个月对患者进行1次随访。

子在第一疗程治疗后，言语流利程度较前改善，四肢肌张力明显降低，行走站立稳定性提高，自然站立时足距轻度增大（10～25 cm），步速加快，可跑跳，可以走线行走，可单腿站立（10～20 sec），闭目难立征阳性（睁眼正常，闭眼轻度晃动）。余无明显变化。第二疗程治疗前发现，患者足距正常（<10 cm），双眼凝视时短暂眼震消失。第二疗程治疗后，双手肌张力较前进一步下降，双手拇指及食指外展仍轻度受限。双臂肌张力恢复正常，双下肢肌张力接近正常，行走接近正常，速度加快，可跑跳，可以走直线，可单腿站立（10～20 sec），可双足并立下蹲站起。闭目难立征阳性（睁眼正常，闭眼轻度晃动）。双眼凝视时无眼震，眼球追踪检查者手指时无跳跃。余无明显变化。治疗后ICARS评分、ADL评分、改良的Ashworth肌张力分级均降低（表 1、2）。

父在第一疗程治疗后饮水呛咳消失，言语较前流利，四肢肌张力下降，行走、站立稳定，行走摇晃减轻，转身仍困难，闭目难立征阳性（睁眼轻度晃动，闭眼明显晃动）。右手指鼻稳准，左手指鼻略有偏差，余无明显变化。第二疗程治疗前发现，患者行走稳定性增强，转身自如，但双手指鼻欠稳准，双眼凝视时有持续眼震，双眼扫视时存在辨距不良。第二疗程治疗后，双手指鼻试验恢复正常，余无明显变化。治疗后ICARS评分、ADL评分、改良的Ashworth肌张力分级均降低（表 1、2）。

父子2人每次治疗后均无任何不良反应，分别在第二疗程治疗后7个月及8个月内病情稳定，随后症状均逐渐加重。

表1 患者治疗前后ICARS及ADL评分Table 1 ICARS and ADL score before and after the treatment

表2 患者治疗前后改良的Ashworth肌张力分级的变化Table 2 Modified Ashworth Scale before and after the treatment

4 讨论

遗传性痉挛性截瘫（HSP）是一种罕见的遗传性脊髓小脑变性病。主要由于皮质脊髓束和脊髓小脑束轴索变性和脱髓鞘所引起，脊髓前角、基底节、小脑、脑干、视神经也可受累。HSP发生率低，国外发病率为0.096‰，国内尚无其流行病学调查结果。HSP有3种遗传方式，为常染色体显性遗传（AD-HSP）、常染色体隐性遗传 （AR-HSP）和X连锁隐性遗传（X-linked HSP），这些遗传方式中，AD-HSP约占70%[4]。根据临床表现，HSP可分为单纯型和复杂型。该家系有明确的家族遗传史，连续4代发病，男女皆有，父子俩表现为肌张力增高、腱反射亢进、病理反射阳性、构音障碍、眼球震颤、共济失调，儿子发病较其父提前。根据家系图谱遗传特点和临床表现，考虑该家系为复杂型HSP，为常染色体显性遗传。该病至今无特效药物治疗。由于疾病进行性进展，最终患者将丧失自主生活能力，给患者及家庭造成沉重的负担。而间充质干细胞（MSC）在修复中枢神经系统损伤和疾病方面具有潜在作用，为遗传性神经变性疾病的治疗带来希望。

人脐带华尔通胶含有丰富的MSC。MSC在体外能够大量扩增，还可冻存、复苏，短期内即可获得足量细胞用于临床治疗。UC-MSC不表达与移植排斥相关的HLA-DR，在混合淋巴细胞检测中呈免疫抑制，并抑制T细胞增殖，异体移植该细胞可产生免疫耐受性[5]，表明其为一类免疫缺陷细胞，异基因移植不会发生免疫排斥反应。

动物实验已证明，MSC具有促进神经修复的作用。将人UC-MSC移植至帕金森模型大鼠和正常大鼠，无排斥反应，无肿瘤产生及其他不良反应。治疗后的第6周，尤其第12周，帕金森模型大鼠临床症状得到明显改善。其作用机理可能与人UC-MSC分泌多种多巴胺神经元营养因子和成纤维细胞生长因子有关，抑或与人UC-MSC具有的免疫抑制作用有关，使得受损的神经元恢复功能[6]。移植人UC-MSC可明显改善共济失调小鼠运动功能，减轻小脑萎缩，植入的UC-MSC可在小脑中停留至少3个月而无明显分化，其作用机制可能与其提高某些神经营养因子如胰岛素样生长因子-1（IGF-1）及血管内皮细胞生长因子（VEGF）在小脑中的表达有关[7]。移植人UC-MSC可有效改善中风模型大鼠的神经功能。人UC-MSC有向大脑缺血区迁移的能力，在损伤区域向胶质细胞、神经细胞、血管内皮细胞分化，促进损伤部位神经及血管形成，进而改善缺血区的血流。人UC-MSC分泌的各种神经营养因子在神经损伤修复中起到重要作用[8-9]。在临床试验中，Lee等将自体骨髓MSC通过静脉或动脉输注治疗11例多系统萎缩（MSA）患者，经过12个月的观察研究，发现症状得到明显改善，UMSARA评分有显著差异。认为自体骨髓MSC治疗是安全的，在一定时期内延迟了疾病的进展[10]。我中心采用UC-MSC鞘内注射治疗22例脊髓损伤（SCI）患者，13例有效，9例无效。不完全性SCI患者有效率达81.25%，完全性SCI的6例患者均无效。有5例有效的患者接受了2或3个疗程治疗，疗效均有进一步的提高。且有效患者疗效持久[11]。我中心采用UC-MSC鞘内注射治疗脊髓小脑性共济失调（SCA）与多系统萎缩小脑型（MSA-C）24例患者中23例有效，其中3例接受第二疗程治疗后获得了进一步疗效，41.61%的患者随访半年以上疾病仍在稳定状态，而58.33%的患者在治疗后1～14个月（平均3个月）疾病进行性发展[13-14]。本报道中父子2人经过UC-MSC鞘内注射治疗1个疗程后四肢肌张力降低、行走站立稳定性增加、言语较前流利，经第二疗程治疗后病情有进一步改善，但随访观察发现疗效不能持久保持。

目前认为，MSC治疗神经变性疾病的机制，可能与MSC介导的神经保护作用有关，通过分泌的多种神经营养因子 （NTF），如脑源性神经营养因子（BDNF）、胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）、β 神经生长因子 （β-NGF）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）等，支持神经细胞生存，诱导内源性神经细胞再生，促进神经纤维在损伤部位再生；而神经炎性机制在神经变性疾病发病机制中起着重要的作用，通过细胞间的接触、免疫抑制相关的多种细胞因子的分泌，抑制T淋巴细胞活性，调节炎性反应，从而达到治疗作用[8-9，14-16]。

在安全性方面，我中心采用UC-MSC鞘内注射治疗22例SCI患者，治疗后1例出现头痛，1例出现腰痛，均在1～3 d内消失，随访3个月～3年，无治疗相关不良反应发生[10]。我中心采用UC-MSC鞘内注射治疗24例SCA与MSA-C患者，治疗后2例出现头晕，2例出现腰痛，2例出现头痛，均在1～3 d内消失[12]。本报道中的2例患者经4个疗程治疗后，均未见任何不良反应发生，表明UC-MSC鞘内注射治疗是安全的。

对于神经变性疾病，由于病因无法根除，UCMSC疗效仅能维持一定时间，随着移植细胞的凋亡，疗效将会终止，疾病仍会进展。父子2人各通过2个疗程治疗后，神经功能得到改善，但分别在15个月及16个月后出现疾病进行性进展。因此，间断给予UC-MSC治疗可能是维持疗效的一种方法。本报道病例数量少，治疗安全性、疗效、治疗机制等需要大量病例的长期研究。

参考文献

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