土壤中产α-淀粉酶菌株的分离和筛选

杨 杨，刘毕琴，张 发，廖光辉，杨晓燕

（大理学院农学与生物科学学院，云南大理 671003）

α-淀粉酶（α-amylase），编号：EC 3.2.1.1，作用于淀粉时从淀粉分子的内部随机切开α-1，4糖苷键，是一种只能催化水解直链淀粉的液化酶〔1〕。通常采用酶活力（enzyme activity）来表示酶催化一定化学反应的能力〔2〕。一般情况下，α-淀粉酶的作用温度范围60～90℃，最适宜作用温度为60～70℃，作用pH值范围5.5～7.0，最适pH值为6.0。α-淀粉酶主要存在于人的唾液和胰脏中，也存在于麦芽、蟑螂涎腺、芽孢杆菌、枯草杆菌、黑曲霉和米曲霉中。α-淀粉酶酶制剂大量应用于粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织品工业和医药行业等，占酶制剂市场份额的25%左右〔3-4〕。目前，工业生产上都以微生物发酵法大规模生产α-淀粉酶，最常用的方法是从自然界中筛选出可以产这种酶的目的菌种，大致可以分为以下4个步骤：采样、增殖培养、纯种分离和性能测定〔5-6〕。土壤是微生物生活的大本营，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到期望中的菌株，再对菌株进行发酵培养，生产出所需的酶〔7〕。由于我国的α-淀粉酶制剂的品种和生产菌株都很单一，α-淀粉酶酶活力相对于国外同行业的较低〔8〕。本研究旨在从富含淀粉类物质的土壤中分离纯化出产α-淀粉酶的菌株，通过水解圈直径和菌落直径的比值，结合酶活力大小进行比较，筛选出产酶活力较强的菌株，并对其所产的酶进行初步的酶学性质研究。研究结果可为α-淀粉酶的生产提供种质资源，同时也为生产实践提供数据支持和理论参考。

1 材料

1.1 样品采集 土壤样品分别采自大理学院校园面食食堂附近空地、晾晒谷物空地、食堂附近绿化带和洗碗池旁，共4份，编号1～4。

1.2 培养基的制备

1.2.1 淀粉琼脂培养基 2.0 g可溶性淀粉，10 g蛋白胨，5 g牛肉膏，5 g NaCl，加少量蒸馏水加热溶解，然后称量16 g琼脂加入烧杯中溶化，补蒸馏水至1000 mL，再用1 mol/L的NaOH或1 mol/L的HCl，调节 pH 至6.4〔9〕。

1.2.2 产α-淀粉酶发酵培养基 22.5 g面粉、10 g牛肉膏、2 g NaNO3、1.5 g K2HPO4、0.5 g MgSO4、0.005 g FeS04·7H2O，补蒸馏水至500 mL〔10〕。

2 方法

2.1 α-淀粉酶产生菌的分离 在超净工作台上，各称取土样10 g，分别加入到装有90 mL无菌水的灭菌三角瓶中，震荡摇匀，置80℃水浴10 min，以倍比稀释法分别制备10-4～10-6稀释度的土壤悬液。用移液管从10-4、10-5、10-6这3个梯度的试管中取土壤悬液1 mL注入无菌培养皿中，然后加入适量经过灭菌融化的淀粉琼脂培养基，摇匀、冷却、标记后，倒置于37℃恒温培养箱中培养24～48 h〔9〕。待长出菌落后，将新碘标准液加入到生长最好的平板中，菌落周围若形成水解圈，便是产α-淀粉酶的菌株，测量这些菌株的菌落直径和水解圈直径，记录编号。挑取有水解圈的单菌落，转接平板，得到纯种，继续转接于平板和试管斜面，37℃培养24 h后置4℃冰箱保藏，作为工作菌株备用。

2.2 α-淀粉酶的酶活力测定

2.2.1 发酵培养 找出每种菌株生长最好的稀释度平板，将该稀释度平板制成菌悬液。以接种量为4 mL，接到发酵培养基中，最适发酵初始pH值为7，装液量为40 mL。发酵温度为33.5℃，摇床培养72 h，进行发酵培养〔11〕。

2.2.2 原酶液的制备 首先，采用硫酸铵沉淀法从发酵液中粗提取α-淀粉酶〔12〕。全部操作过程均在室温下进行。每种菌株发酵液以4000 rmp离心10 min去菌体，所得上清液为粗酶液。粗酶液各取5 mL，分别同时加入1.87 g（NH4）2SO4细粉末，混匀，静置30 min。以4000 rmp离心10 min，离心去除上清液保留沉淀，将沉淀在40℃下烘干，制成酶粉。再将0.1 g酶粉溶于1 mL无菌水，制成原酶液。

2.2.3 酶活力的测定 反应体系为5 mL 0.5%淀粉和0.5 mL稀释了200倍的原酶液，pH值6.0，50℃下反应5 min后，加0.1 mol/L H2SO45 mL终止反应，取0.5 mL反应液加入5 mL Lugol氏碘液稀释液，溶液显色，在660 nm波长下测吸光度。查看吸光度与α-淀粉酶酶浓度对照表〔13〕，找出相应测试酶液的浓度，通过下面公式计算出样品的酶活力。

公式：X=cn，

式中：X为样品的酶活力〔U/g（U/mL）〕，

c为测试酶液的浓度（U/mL），

n为样品的稀释倍数。

2.3 α-淀粉酶产生菌的形态学观察 将产酶活力最强的菌株接种于淀粉琼脂培养基〔9〕，37℃恒温培养箱中培养24 h后观察菌落的形态特征，并通过革兰氏染色和芽孢染色法对菌株进行形态学鉴定〔14〕。

2.4 α-淀粉酶学性质研究

2.4.1 α-淀粉酶最适反应温度 分别取制备好的产酶活力最强菌株的发酵液5 mL，在温度梯度为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的情况下测定酶活力，以确定α-淀粉酶最适反应温度。

2.4.2 酶反应最适pH值 反应体系的pH值分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的缓冲液，再将0.1%可溶性淀粉作为底物，加入5 mL制备好的产酶活力最强菌株的发酵液反应5 min，测定酶活力，以确定该酶反应最适pH值。

3 结果

3.1 α-淀粉酶产生菌的筛选 从土壤样品共分离到4株α-淀粉酶产生菌，水解圈测定结果见表1。由表1可见，菌株4的内外径比值较大，为2.800。

表1 菌株水解圈直径比较

3.2 α-淀粉酶的酶活力测定 菌株1～4的酶活力测定结果见表2。从表2可知，菌株4产酶活力最高。

表2 酶活力的计算结果

3.3 菌株4形态学特征 菌株4的菌落表面光滑，不透明，呈规则的圆形。菌体经革兰氏染色呈杆状，为革兰氏阳性菌。经芽孢染色后菌体中可见绿色芽孢，故初步鉴定菌株4为芽孢杆菌。

3.4 α-淀粉酶酶学性质

3.4.1 菌株4产α-淀粉酶酶促反应最适温度 结果见图1。由图1可知，菌株4产α-淀粉酶酶促反应最适温度范围为50～60℃

图1 α-淀粉酶热稳定性

3.4.2 菌株4产α-淀粉酶酶促反应最适pH值 结果见图2。由图2可知，菌株4产α-淀粉酶酶促反应适合pH值范围在4.0～7.5之间，最适pH值为6.2。

图2 不同pH值反应体系中对酶活力的影响

4 讨论

菌株4所产酶的酶活力最强，其所在土壤表层含淀粉类物质最多，水分充足。推测这样的土壤适合产淀粉酶活力较强的菌株的生长。

在测定α-淀粉酶酶活力时常采用白瓷板目视比色法。该方法是以酶与淀粉的呈色反应为基础，肉眼观察酶反应的终点，直接根据公式计算酶活力。虽然此方法简便快速，但是在确定反应终点时，由于主观因素的影响会造成误差，并且标准色的不稳定性以及色泽与反应液的不一致，都将影响酶活力最终计算结果。因此，本实验在测定α-淀粉酶酶活力时均采用分光光度计法，此方法克服了白瓷板目视比色法的各种缺点。同时应用（NH4）2SO4盐析法，粗提取α-淀粉酶，将该酶稀释200倍，吸光度便调整到了0.178～0.425范围内，可以查看吸光度与α-淀粉酶酶浓度对照表〔14〕，计算酶活力，这样更准确可靠。

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