滴注空气在脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤模型建立过程中的作用

原铭贞，高广媛，李 波，董春玲，王司仪，梁豪君，刘相良，孙笑非

（1.吉林大学白求恩医学院人体解剖学系，吉林 长春 130021；2.吉林大学第二医院呼吸内科，吉林 长春 130041；3.辽宁省锦州石化医院骨科，辽宁 锦州 121000）

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）和急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是指进行气体交换时肺部实质各种直接或间接损伤所导致的急性低氧型呼吸衰竭的临床综合征[1－2]。迄今为止，ALI/ARDS的发病机制尚未完全阐明，其死亡率仍高达40%以上[3－5]。脂 多 糖（lipopolysaccharide，LPS） 诱 导的实验动物模型与人体发生的ALI/ARDS非常相似，有助于进一步揭示 ALI/ARDS的发病机制[6－8]。可靠的动物模型有助于进一步阐明 ALI/ARDS的发病机制[9－11]。前期研究中，本课题组比较了暴露式与非暴露式气管滴注方法建立的小鼠ALI模型[12]发现：暴露式气管滴注法LPS诱导的小鼠肺部炎症反应更加严重，这可能是由于暴露式气管滴注法促进了LPS在肺内的分布，可以将更多的LPS通过各级支气管输送至肺泡腔内。而在采用暴露式气管滴注法给药时，滴注空气是关键性因素，其很可能与LPS的肺内运输及其诱发的炎症反应有密切关联。与此同时，气管滴注时滴注空气已经用于纳米材料肺部毒性的研究[13]。但至今为止，滴注空气对于气管滴注方法和ALI动物模型的影响尚缺乏客观、系统的评价。本研究采用暴露式气管滴注方法建立内毒素性小鼠ALI模型，着重研究滴注空气对LPS诱导的小鼠早期肺部炎症反应的影响，旨在揭示滴注空气在建立小鼠ALI模型过程中的重要作用，进而确立一种更加行之有效的气管滴注方法。

1 材料与方法

1.1 动物和主要试剂 45只成年雄性C57BL/6J小鼠，体质量18～22g，购自吉林大学白求恩医学院实验动物中心，合格证号：SCXK（吉）2008-0005；LPS（B.E.coli055：B5）和戊巴比妥钠购自美国Sigma公司。实验设计经本院动物保护委员会同意，动物使用和处理遵照美国国立卫生署颁布的 《实验动物关护和使用指南》。

1.2 实验分组及给药 45只健康雄性C57BL/6J小鼠随机分为对照组、LPS组和LPS＋空气组，每组15只。以LPS作为刺激物，LPS组和LPS＋空气组小鼠采用暴露式气管滴注方法建立ALI模型，LPS＋空气组小鼠进行气管滴注前1mL注射器内预先吸入100μL空气。对照组小鼠不进行任何处理。各组小鼠于造模后24h收集标本。

1.3 小鼠ALI模型制备 采用暴露式气管滴注方法建立ALI模型[14]。每只小鼠腹腔注射0.1mL戊巴比妥钠（50mg·kg－1）进行麻醉，麻醉生效后将小鼠头向上使其仰卧于一块木板上，木板倾斜与水平面呈50°角。在小鼠颈部做一纵行切口，暴露气管，使用末端连有1mL注射器的小儿头皮针，经气管壁插入气管内，将预先吸好的LPS溶液（5mg·kg－1）快速滴注至小鼠肺内。气管滴注后将小鼠直立，垂直旋转小鼠，使药物在肺内均匀分布。

1.4 小鼠支气管肺泡灌洗 每组随机取5只小鼠，处死后，将小鼠固定在操作台上，暴露气管后用一次性静脉留置针进行气管插管，丝线结扎固定，然后用1mL注射器每次取1mL生理盐水，经气管套管冲洗小鼠双侧支气管肺泡，反复注入回洗3次后回收小鼠支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），重复3次，回收率为85%～89%。将回收的BALF混匀，300g离心5min。取上清液测定BALF中碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性以及总蛋白浓度。BALF离心后的细胞用100μL PBS重悬，取少许采用细胞计数板进行细胞计数，计算每毫升的细胞数，采用台盼蓝染色法检测细胞活力。剩余细胞再次离心后弃上清，采用100μL PBS重悬后使用细胞离心机涂片，晾干后瑞氏快速染色，光学显微镜下进行细胞分类计数。

1.5 小鼠肺湿/干重（W/D）比值测定 每组随机取5只小鼠，处死后，固定于操作台上，暴露气管后打开胸腔，观察小鼠肺形态。剪断气管后取全肺，称湿重，然后将小鼠肺置于60℃恒温箱中干燥，72h后取出称量干重，计算肺W/D比值。

1.6 小鼠肺组织病理形态学观察 每组取5只小鼠，处死后，暴露气管，用一根导管插入气管，结扎固定后，以距水平20cm高度将4%多聚甲醛注入到小鼠肺中，内固定30min。内固定后，拔出导管，结扎气管，将全肺置于4%多聚甲醛中固定24h，然后将肺组织常规脱水，石蜡包埋，切片（厚度为5μm），行苏木精－伊红（HE）染色。光学显微镜下观察小鼠肺组织水肿、中性粒细胞浸润和出血情况，从而评定肺的损伤程度。

1.7 统计学分析 采用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析。各组小鼠BALF中总蛋白浓度、ALP和LDH活性、细胞分类计数和肺W/D比值均以±s表示，组间比较均采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 各组小鼠BALF中生化指标 与对照组比

较，LPS组和LPS＋空气组小鼠BALF中ALP和LDH活性以及总蛋白浓度显著升高（P＜0.05）；与LPS组比较，LPS＋空气组中ALP和LDH活性以及总蛋白浓度均显著升高（P＜0.05）。见表1。

2.2 各组小鼠BALF中细胞分类计数 与对照组比较，LPS组和LPS＋空气组小鼠细胞总数和中性粒细胞数量显著升高（P＜0.05）；与LPS组比较，LPS＋空气组小鼠细胞总数和中性粒细胞数量明显升高（P＜0.05）。见表1。

2.3 各组小鼠 W/D比值 LPS组和LPS＋空气组小鼠肺 W/D比值明显高于对照组（P＜0.05），LPS＋空气组小鼠肺 W/D比值明显高于LPS组（P＜0.05）。见表1。

表1 各组小鼠BALF中生化指标、细胞分类计数和肺W/D比值Tab.1 Biochemical indexes in BALF，cell differential counting，and lung W/D ratios of mice in various groups（n＝5，±s）

表1 各组小鼠BALF中生化指标、细胞分类计数和肺W/D比值Tab.1 Biochemical indexes in BALF，cell differential counting，and lung W/D ratios of mice in various groups（n＝5，±s）

＊ P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs LPS group.

ratio Control 35.9±2.2 57.6±12.7 38.5±3.3 19.5±4.Group ALP activity[λB/（U·L－1）]LDH activity[λB/（U·L－1）]Total protein concentration[ρB/（mg·dL－1）]Cell counting（×104 mL－1）Lung W/D Total cells Neutrophils 9 2.0±0.7 4.0±0.2 LPS 54.2±6.2＊ 732.1±61.8＊ 135.2±9.9＊ 125.9±10.8＊ 102.6±9.7＊ 5.0±0.2＊LPS＋air 78.0±5.2＊△ 967.5±97.6＊△ 168.9±12.5＊△ 175.2±18.2＊△ 146.3±11.3＊△ 5.6±0.2＊△

2.4 各组小鼠肺组织病理形态学 HE染色，与对照组比较，LPS组和LPS＋空气组小鼠肺组织内均有不同程度的液体积聚、中性粒细胞浸润、充血和出血；与LPS组比较，LPS＋空气组小鼠肺泡腔内积聚了更多富含蛋白的液体、中性粒细胞和红细胞。见图1（插页一）。

3 讨 论

ALI/ARDS的发病机制涉及到肺泡上皮细胞和血管内皮细胞损伤、中性粒细胞浸润和渗透性肺水肿[1，7]。在ALI发病过程中，肺泡巨噬细胞和上皮细胞受到刺激，释放大量趋化因子[15]。趋化因子诱导中性粒细胞从血管腔内穿越血管内皮和肺泡上皮迁移至气道表面[16－17]。中性粒细胞及其产物引起血管内皮和肺泡上皮的损伤，进而导致肺通透性增强，大量富含蛋白的水肿液积聚于肺泡腔内[18－19]。肺泡上皮的炎性损伤也损害了其主动清除肺泡腔内液体和产生表面活性物质的能力，进一步加重了肺水肿。

肺泡上皮细胞与血管内皮细胞损伤是ALI/ARDS的主要病理学特征之一。外源性致病因素如LPS进入肺内，与肺泡上皮细胞直接接触的同时对其造成损伤。而大量活化的中性粒细胞在迁移过程中所释放的毒性介质，包括金属蛋白酶、氧化剂和多肽类等[20]，则是肺泡上皮和血管内皮损伤的主要原因。最新研究[21]表明：固有免疫效应器机制－中性粒细胞外核染色质和抗菌因子形成的trpslattices结构在捕获病原体的同时也导致了内皮的损伤。BALF中ALP和LDH活性以及总蛋白浓度用于评价细胞损伤的程度。Ⅱ型肺泡上皮细胞分泌水平常用ALP活性来表示，BALF中ALP活性的升高被认为是Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤的一个重要标志。LDH是一种胞浆酶，常用作评定细胞损伤的标志物。BALF中总蛋白浓度的增加通常与血管通透性的增高一致，表明细胞损伤破坏了肺部血气屏障的完整性。本研究结果表明：无论滴注空气与否，气管滴注LPS均导致不同程度的细胞损伤；滴注空气加重了LPS诱导的细胞损伤。

中性粒细胞浸润作为ALI/ARDS发展早期的重要环节[22]，是ALI患者的主要病理学特征并逐渐进 展 为 ARDS[23－24]。肺 组 织 内 白 细 胞 介 素 8（interlukin-8，IL-8）水平的升高提高了早期中性粒细胞的迁移能力，并且在中性粒细胞浸润过程中扮演重要角色。中性粒细胞浸润的数量也与ALI/ARDS的严重程度以及预后有密切关联。BALF中细胞分类计数用于评价迁移细胞的数量和种类，从而进一步表明肺部感染的类型和程度。本研究结果表明：无论滴注空气与否，气管滴注LPS均诱导了不同程度的中性粒细胞浸润；滴注空气促进了LPS诱导的中性粒细胞浸润。微血管屏障通透性的增加引起蛋白丰富的水肿液在血管外聚集，这也是 ALI/ARDS的一个主要病理学特征[25－26]。通透性的增加也与ARDS时白细胞和红细胞转移进入肺泡腔以及炎性体调节的细胞因子有关联[27]。多种介质、通路和分子系统参与改变肺泡内皮和上皮通透性进而诱导了肺水肿的发生[28－32]。肺 W/D比值常用来评价肺水肿的严重程度。本研究结果表明：无论滴注空气与否，气管滴注LPS均导致了肺水肿的发生；滴注空气促进了LPS诱导的肺水肿。细胞损伤、中性粒细胞浸润和肺水肿作为ALI/ARDS的主要病理学特征，成为ALI造模效果的评价标准。本研究结果表明：LPS组和LPS＋空气组均成功建立了小鼠ALI模型，且成功率均达到100%。与此同时，LPS＋空气组诱发的细胞损伤、中性粒细胞浸润和肺水肿比LPS组更加严重，证明气管滴注时滴注空气促进了LPS诱导的ALI。

气管滴注方法的优化与改进，有助于提高ALI动物模型的造模效果，对于阐明ALI/ARDS的发病机制具有重要意义。本研究使用气管滴注装置，体外观察滴注空气对液体排出的影响。单独滴注液体时，液体在针头尖端形成大的液滴，快速滴落。滴注完成后，针头内残存少量液体。滴注预先吸入的空气和液体可以使液体排出时呈喷射状，快速排空，针头内无残存液体。这就意味着气管滴注时，预先吸入的空气可以确保LPS溶液的排空，将更多的LPS通过各级支气管快速输送至肺泡腔内。而ALI/ARDS作为肺泡疾病，主要表现为肺泡上皮细胞与内皮细胞屏障的破坏和继发的氧合功能障碍。滴注空气可以使LPS充分与肺泡上皮细胞接触，继而诱发更加严重的急性肺部炎症反应，更好地模拟人体ALI/ARDS的发病过程，提高造模效果。

综上所述，气管滴注时滴注空气能够促进LPS诱导的ALI。本研究首次揭示了滴注空气对LPS诱导的小鼠ALI模型的影响，有助于改进气管滴注方法，建立更加完善的ALI动物模型，为进一步阐明ALI/ARDS的发病机制提供依据。与此同时，滴注空气有可能将更多的LPS运送至肺泡腔内从而引起更严重的肺部炎症反应，这对于其他动物模型的建立和药物干预方式均有重要的指导意义。

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