微囊藻毒素-LR的分离纯化

张淑华，王晴，陈玉娟，葛淑敏

（长春理工大学 生命科学技术学院，长春 130022）

随着水体环境污染的加剧，水中有害蓝藻水华事件频繁发生，已成为国内外普遍关注的环境问题。微囊藻毒素为有害蓝藻释放的一类具有强烈促癌作用的肝毒素［1］。微囊藻毒素-LR（MC-LR）是微囊藻毒素中毒性最强的一种。大量研究表明，动物肝脏是MC-LR作用的重要靶器官，可导致肝脏损伤继而发展成肝癌。最近研究表明，除肝脏外，MC-LR也可引起生物急性肾损伤，免疫系统紊乱，甚至影响生物的生殖系统，具有遗传毒性［2-4］。这给人体健康带来了巨大的威胁与隐患。世界卫生组织规定饮用水中 MC-LR 的限定值为 1μg/L［5］，并于1998年正式纳入饮用水标准中。我国2007年出台的新版《生活饮用水标准》也已将微囊藻毒素列入了水质监测指标中。

目前，MC-LR的结构性质已明了。国内外对其毒性作用机制、检测方法、治理手段、疾病治疗等方面正展开积极的研究。本文利用萃取、高效液相层析法等从铜绿微囊藻中分离纯化MC-LR，为MC-LR的上述相关研究提供纯品。

1 实验材料与方法

1.1 实验菌株

铜绿微囊藻FACHB905购自中国水生生物研究所。

1.2 主要试剂与器材

MC-LR标准品购自瑞士Alexis公司；硝酸钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、柠檬酸、柠檬酸铁铵、乙二胺四乙酸二钠、碳酸钠、硼酸、氯化锰、硫酸锌、硫酸铜、钼酸钠、硝酸钴、甲醇、乙酸乙酯、乙酸等均购自北京化工厂，上述均为分析纯。

高压灭菌锅（YXQ-LS-50A）、高速低温离心机（Scanspeed1736R）、超净工作台（BJ-2CD）、超声波细胞破碎仪（JY650）、高效液相色谱仪（Agi-lent1200）、旋转蒸发仪（RE-2000A）、冷冻干燥机（ALPHA2-4）等均由本实验室提供。

1.3 实验方法

1.3.1 铜绿微囊藻的培养与藻细胞收集

（1）在无菌的条件下，将由中国水生生物研究所购买的FACHB905藻液平均分为两部分，分别接入装有30mL已灭菌的BG-11的锥形瓶中，用血细胞计数板进行计数记下初始藻细胞浓度。

（2）在室温条件下采用自然光照静置培养，每天定期摇动8～10次，每隔一天用血细胞计数板进行计数以掌握铜绿微囊藻的生长情况。

（3）通过血细胞计数板计算藻细胞数绘制铜绿微囊藻的生长曲线，确定其对数生长期，同时在对数生长期接种进行扩大培养。

（4）当铜绿微囊藻培养至藻细胞数最大时开始收集，将藻液于25℃下，10000rpm离心5min，收集细胞沉淀。

1.3.2 溶液萃取

（1）收集到的藻细胞沉淀按体积比1∶3加蒸馏水重悬，重悬后用超声波进行细胞破碎，超声波破碎条件为400W，工作3s，停顿4s，超声100次。

（2）超声后藻液分成两份，分别加入等体积乙酸乙酯溶液和1.5倍体积的甲醇溶液，再次超声，条件如（1）中所述。

（3）再次超声后，25℃，10000rpm离心7min，添加乙酸乙酯溶液的离心管中物质分三层，取最下层水相溶液，而添加甲醇溶液的离心管中物质分两层，取上清溶液，分别用漏斗过滤，滤液分别存放于4℃过夜。

（4）滤液重新离心，条件如（3）中所述，留取上清液，用0.22μm滤膜过滤，滤液于4℃保存。

1.3.3 MC-LR纯化

（1）添加乙酸乙酯溶液萃取得到的最终滤液等体积加入甲醇溶液去除杂蛋白，25℃，10000rpm离心10min，取上清液，用0.22μm滤膜过滤，滤液即为MC-LR粗品。而直接添加甲醇溶液萃取得到的最终滤液无需经过此过程。用HPLC分别分析检测两种萃取方法获得的MC-LR粗品，对比两种溶液萃取方法的优劣。

（2）MC-LR粗品经HPLC纯化，色谱条件为：

柱温：室温；检测波长：238nm；流速：1mL/min（分析柱），20mL/min（制备柱）；流动相为含有0.32%乙酸的水：甲醇（40∶60）。

（3）收集目的馏分并通过旋转蒸发仪去除甲醇，然后进行冷冻干燥得到MC-LR纯品。

2 实验结果与讨论

2.1 铜绿微囊藻的培养

图1 铜绿微囊藻生长曲线

将由中国水生生物研究所购得的铜绿微囊藻转接后在室温（25℃）条件下自然光光照静置培养，每天定期摇动8～10次，并且每天进行血细胞计数记录细胞数，根据细胞数绘制藻细胞生长曲线如图1所示。研究表明，处于生长期的蓝藻细胞能主动释放约40%的毒素，而大部分（60%～80%）的毒素都是在藻细胞衰老和死亡时才释放［6］，因此确定藻细胞的生长周期对掌握收集藻细胞提取MC-LR的时期十分重要。由图1可以看出，铜绿微囊藻开始培养后在第5d进入对数生长期，培养到第8d时细胞数最大，进入稳定期（稳定期是代谢产物尤其是次级代谢产物产生的主要时期）。第9d左右开始出现生长下降趋势。根据细胞在对数生长期生长最快的原理，试验中取培养6d的藻液转接新鲜培养液中进行扩大培养（比例为1∶8），由于细胞进入衰亡期后期会出现自溶现象，为后续分离带来很大的麻烦，所以综合考虑后确定，藻细胞大量收集的最佳时间为培养后第8-9d，收集足够多的藻细胞后进行MC-LR提取。

2.2 MC-LR的提取

将收集的藻细胞用超声波破碎仪破碎。超声波破碎时的时间和功率及破碎过程中产生的热量对MC-LR的提取效率及生物活性均有影响，经试验分析采用400W，工作3s，停顿4s，超声100次的操作方式综合效果最好。

收集破碎藻液，分别采用乙酸乙酯-甲醇和甲醇作为萃取剂进行萃取，将两种萃取方法获得的MC-LR粗提液的HPLC色谱图与MC-LR标准品的HPLC色谱图进行对比分析发现，由乙酸乙酯萃取除去杂质再用甲醇除杂蛋白的效果比直接用甲醇溶液进行萃取的效果好，杂质较少。这可能是因为甲醇极性较大，萃取后溶液中含有可溶于甲醇的极性强和极性弱的杂质，而先加极性较弱的乙酸乙酯可去除极性较弱的杂质。因此，选用乙酸乙酯-甲醇这种萃取方法获得的MC-LR粗提液进行进一步纯化效果较好。

2.3 MC-LR的纯化

经乙酸乙酯-甲醇萃取后得到的粗提液采用高效液相色谱法进行进一步纯化，经条件摸索得到纯化条件为柱温：室温；检测波长：238nm；流速：1mL/min（分析柱），20mL/min（制备柱）；流动相为含有0.32%乙酸的水：甲醇（40∶60）。经与MC-LR标准品的HPLC分析图谱（图2）相比，上述条件下MC-LR纯化效果（图3）较理想。收集目的馏分，通过旋转蒸发除去甲醇，再经冷冻干燥获得纯品固体粉末，纯度可达94%。

图2 MC-LR标准品高效液相色谱图

图3 MC-LR纯品高效液相色谱图

3 结论

通过培养铜绿微囊藻和血细胞计数板计算细胞数，观察铜绿微囊藻的生长周期，确定其第5d进入对数生长期，第6d进行移种扩大培养，接种比例为1∶8，第8d藻细胞数量最大，藻细胞大量收集的最佳时期为铜绿微囊藻培养后的第8-9d，之后用于MC-LR的提取。

将收集到的藻细胞采用超声波细胞破碎仪在400W，工作3s，停顿4s，超声100次的条件下进行细胞破碎，然后对乙酸乙酯-甲醇和甲醇两种溶剂萃取方法的萃取效果进行比较，得出先用乙酸乙酯萃取细胞破碎液中极性较弱的杂质，再用甲醇除杂蛋白的除杂效果较好。对经乙酸乙酯-甲醇溶剂萃取得到的MC-LR粗提液进行过滤，并采用HPLC进行进一步纯化，纯化条件为柱温：室温；检测波长：238nm；流速：1mL/min（分析柱），20mL/min（制备柱）；流动相为含有0.32%乙酸的水：甲醇（40：60）。最终经冷冻干燥获得MC-LR纯品，经分析纯度可达94%。

本文分离纯化得到的MC-LR可用于MC-LR毒性作用机制、MC-LR所致水体污染检测及水体污染治理等相关方面的研究，为水体环境的检测、保护及人体健康等方面提供有效服务。

［1］Dawson R M.The toxicology of microcystins［J］.Toxicon，1998，36（7）：953-962.

［2］Liu Y D，Song L R，Li X Y.The toxic effects of microcystin-LR on embryo-larval and juvenile development of loach，Misgurunsm izolepis Gunthe.［J］.Toxicol，2002，40（4）：395-399.

［3］CHEN J，XIE P.Tissue distributions and seasonal dynamics of the hepatotoxic microcystins-LR and-RR in two freshwater shrimps，palaemon modestus and macrobrach iumnipponensis，from a large shallow，eutrophic lake of the subtropical China［J］.Toxicon，2005，45（5）：615-625.

［4］CHEN J，XIE P，GUO L，et al.Tissue distributions and seasonal dynamics of the hepatotoxic microcys-tins-LR and-RR in a freshwater snail（Bellamya aerugino sa） from a large shallow，eutrophic lake of the subtropical China［J］.Environ Pollut，2005，134（3）：423-430.

［5］World Health Organization.Guidelines for Drinking Water Quality［R］.Switzerland：Health Organization，Geneva，1998.