β连环蛋白在大鼠酒精性肝纤维化中的表达及意义

苏金玲 姜希娟 郭茂娟 马东明 范英昌 (天津中医药大学病理教研室，天津 300193)

酒精性肝纤维化(AHF)是向酒精性肝硬化发展的必经病理过程，Wnt信号通路参与调控细胞分化、癌变、凋亡及机体免疫、应激等病理生理过程。Wnt信号通路可促进肝纤维化的发生发展，但其在AHF中的作用并不是很清楚，本文通过检测Wnt信号通路的核心蛋白β连环蛋白(β-catenin)在AHF大鼠肝组织中的表达情况，探讨Wnt信号通路在AHF中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 Wistar雄性大鼠60只，中国医学科学院实验动物研究所提供〔许可证号:SCXK9(京)2005-0013〕，体重200 g左右。

1.2 主要实验试剂 62°牛栏山二锅头:由北京顺鑫农业股份有限公司生产;吡唑:购自上海晶纯试剂有限公司;Masson三色染色试剂盒:购于福州迈新生物技术开发有限公司;Ⅲ型胶原前蛋白(PⅢP)、层粘连蛋白(LN)酶联免疫吸附试剂盒购自美国RB公司;RNA提取试剂盒RNA-Solv Reagent购自Omega公司;SYBR PrimeScript TM RT-PCR Kit试剂盒购自TaKaRa公司。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组和模型制备 大鼠适应性饲养1 w，分为正常对照组(N组)30只、模型组(M组)30只。M组大鼠以62°牛栏山二锅头酒(10 ml·kg-1·d-1)、玉米油(2 ml·kg-1·d-1)、吡唑(25 mg·kg-1·d-1)混合物灌服，2次/d，早晚各1次。N组则2次/d以相应容量的生理盐水灌服。两组大鼠实验期间均予全价营养颗粒饲料喂养，自由进食饮水。造模12 w。

1.3.2 取材 于第12周末，所有大鼠禁食12 h，乙醚麻醉后，内眦静脉取血，离心后留取血清备用。颈椎脱臼处死大鼠后迅速剖腹取出肝脏，取肝右叶部分组织置于液氮中冷冻保存，以备检测分子生物学指标之用，取肝左叶部分组织以10%中性甲醛溶液固定，以备检测肝组织形态学指标。

1.3.3 指标观察和检测

1.3.3.1 Masson染色观察肝组织纤维化的情况 按照试剂盒说明书严格操作。胶原纤维面积百分比的测定方法:每张切片选取四周及中央5个区域，均选取该区域胶原纤维含量最多的视野，应用Image-Pro Plus 6.0专业图像分析系统进行图像分析，10倍物镜下测定胶原纤维面积百分比(胶原纤维面积/肝组织面积×100%)，取平均值。

1.3.3.2 酶联免疫法(ELISA)检测大鼠血清LN，PⅢP水平的变化 按试剂盒说明严格操作。

1.3.3.3 实时定量RT-PCR检测β-catenin mRNA的表达 按照RNA提取试剂盒说明书提取大鼠肝组织总RNA，紫外分析及琼脂糖电泳检测总RNA的纯度、浓度及完整性。按照逆转录试剂盒说明书以Random 6 mers和Oligo Dt Primer为引物将总RNA(500 ng)反转录为cDNA(10 μl体系)。β-catenin的引物序列:正义链:5'-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3';反义链:5'-CCCATACCCACCATCACACC-3'。以GAPDH为内参，其引物序列为:正义链:5'-CCCCCAATGTATCCGTTGTG-3';反义链:5'-TAGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3'。PCR反应条件如下:第一步是预变性，95℃，30s(1个循环)。第二步是PCR反应，95℃，5 s;60℃，31 s(40个循环)。反应结束后，使用7300 system SDS software软件分析PCR过程中样本的CT值，每个标本设3个复孔，计算平均CT值，每一次反应均设定阴性对照。采用2-△△CT计算各目的基因相对反应起始拷贝数。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况观察 实验期间N组大鼠无1例死亡。M组大鼠死亡10只，其中因酒精误入气管死亡7只，因急慢性酒精中毒死亡3只。

2.2 Masson染色观察肝组织纤维化情况 胶原纤维被染为蓝色，N组大鼠肝组织中仅有少量胶原表达，主要位于汇管区、中央静脉周围〔(0.23±0.11)%〕;M组大鼠肝组织胶原纤维增生较明显，尤其是中央静脉周围和汇管区部位，已经有少量胶原从汇管区部分向肝小叶内穿插〔(5.67±0.28)%〕。

2.3 大鼠血清LN、PⅢP的水平 M组大鼠血清LN和PⅢP水平较N组显著升高(P＜0.01)。见表1。

表1 各组大鼠血清LN和PⅢP水平(±s，ng/ml)

表1 各组大鼠血清LN和PⅢP水平(±s，ng/ml)

与N组比较:1)P＜0.01

组别 n LN PⅢP N组30 21.11±2.30 2.71±0.52 M组 20 75.65±1.191) 16.51±0.341)

2.4 大鼠肝组织β-catenin表达 M组β-catenin mRNA的表达比N组显著升高〔(3.40±0.15)vs(1.06±0.12)，P＜0.01〕。

2.5 大鼠肝组织β-catenin mRNA表达与肝组织胶原面积及大鼠血清LN和PⅢP水平的相关性分析 β-catenin mRNA的表达与肝组织胶原面积及大鼠血清LN和PⅢP水平呈正相关(r=0.926，0.893，0.902，P ＜0.01)。

3 讨论

AHF因其具有可逆性的特点，因此对AHF的机制研究并寻找治疗AHF的有效靶点一直是国内外研究的热点。肝纤维化的病理学基础为肝脏细胞外基质(ECM)合成增加，降解减少导致肝组织内胶原纤维过度沉积。

PⅢP是Ⅲ型前胶原裂解下来的氨基多肽，早在1979年Rohde等〔1〕首先建立了血清PⅢP的放免法，之后国内外学者应用此方法对肝纤维化进行了大量研究，多数学者认为PⅢP是诊断肝纤维化较好的血清学指标。LN是细胞外基质成分中一种重要的非胶原蛋白，在正常肝组织中无LN，当肝纤维化发生时，LN由肝内的内皮细胞和贮脂细胞合成，并与Ⅵ型胶原结合沉积在Disse腔形成基底膜，LN随着肝纤维化的加重而合成增加。因此LN和PⅢP是检测肝纤维化很敏感的指标〔2〕。

Wnt蛋白及其受体、调节蛋白等组成的复杂信号转导通路，包括经典通路和非经典通路〔3〕。目前研究比较深入的是Wnt经典信号通路，也称 Wnt/β-catenin 信号通路。Wnt/βcatenin信号是一个高度保守的信号通路，是调控细胞生长增殖的关键途径。当经典的Wnt信号途径被激活后，Wnt蛋白与其细胞表面受体Frizzled家族跨膜蛋白结合，继而Frizzled激活散乱蛋白(Dsh/Dvl)，Dsh再激活下游因子GSK-3β结合蛋白(GBP)，激活的GBP能识别并抑制GSK-3β的磷酸化活性，使β-catenin降解复合体失活，导致β-catenin在胞质内的降解停止、蓄积并进入核内，与转录因子TCF结合形成转录复合物，启动下游靶基因的表达〔4〕。当Wnt信号活化引起β-catenin在细胞核内聚集时，可作为该信号通路激活的标志〔5〕。

本研究发现，造模12 w末，模型组大鼠肝组织胶原纤维面积以及血清PⅢP、LN水平高于N组，说明肝纤维化模型制备成功。另外M组大鼠肝组织Wnt信号核心蛋白β-catenin的表达较正常N组升高，并与肝组织胶原纤维面积以及血清PⅢP、LN成正相关，Wnt信号通路的启动在AHF中同样发挥重要的作用，但更为深入具体的机制有待进一步探讨。

1 Rohde H.Radioimmunoassay for typeⅢprocollagen peptide and its application to human liver disease〔J〕.Eur J Chin Invest，1979;9(6):451.

2 刘芳兰，梁碧珊，谢伟贤.透明质酸、层粘连蛋白、甘胆酸及Ⅲ型前胶原联合检测对肝纤维化早期的诊断价值〔J〕.江西医药，2005;40(6):328-9.

3 陶忠桦.Wnt信号转导通路与组织器官纤维化〔J〕.西南军医，2005;12(3):531-3.

4 Moon RT，Kohn AD，De Ferrari GV，et al.Wnt and beta-catenin signalling:diseases and therapies〔J〕.Nature Rev Gene，2004;5(9):691-701.

5 Tolwinski NS，Wieschaus E.A Nuclear function for armadillo/beta-catenin〔J〕.PLoS Biol，2004;2(4):486-93.