顺铂联合热疗对人胃癌耐药细胞增殖及耐药相关基因Survivin表达的影响

董 倩 陈 虎(河北医科大学第四医院化疗科，河北 石家庄 0500)

肿瘤产生多药耐药(MDR)是化疗失败的重要原因之一，寻找能够逆转耐药的方法成为当前的重要研究方向之一。目前发现热疗可能通过不同的作用机制，抑制肿瘤的生长，逆转肿瘤耐药，从而对化疗起到协同和增效的作用〔1〕。本研究通过顺铂联合热疗作用于人胃腺癌耐药细胞株SGC7901/DDP，并观察其对细胞增殖及Survivin表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人胃腺癌耐药细胞株SGC7901/DDP(购买于南京凯基生物有限公司)，置于RPMI1640培养液中，加入浓度为1 μg/ml的顺铂(山东齐鲁制药有限公司产品，批号是9080372DC)以维持耐药性。兔抗人Survivin多克隆抗体(河北博海生物工程开发有限公司)。

1.2 分组 取对数生长期细胞，常规胰蛋白酶消化后，以5.0×105/瓶接种于25 ml培养瓶中，培养24 h待细胞贴壁后，用含顺铂0.1 μg/ml的RPMI1640培养基换液。热疗组、热化疗组在43℃恒温水浴箱中加热2 h后，与对照组、化疗组同时继续于37℃、5%CO2培养箱中继续培养至24 h。常规消化收集细胞，PBS液离心洗涤2遍，用70%冷乙醇(4℃)固定;调整细胞浓度为1.0×106/ml，取 1 ml单细胞悬液，加入兔抗人Survivin抗体 0.1 ml(工作浓度1∶50)，室温孵育 30 min，PBS液洗3次;分别加入羊抗兔 IgG二抗工作液100 μl，避光室温孵育30 min，PBS液洗3次后上机检测。设PBS代替一抗和二抗的阴性对照以及只加二抗的本底对照。

1.3 方法

1.3.1 FCM法检测细胞周期分布和细胞凋亡 取对数生长期细胞，用PBS液洗涤2次，再用盐水洗涤2次，弃去上清，加入溴化丙啶1 ml染色，冰浴30 min，铜网过滤制成单细胞悬液，用流式细胞仪对细胞的DNA定量分析，计算出细胞周期的时相分布和凋亡率，按公式计算增殖指数(PI)。

1.3.2 FCM法半定量检测细胞的Survivin蛋白的表达 取对数生长期的细胞，各组均重复3瓶。常规消化收集细胞，PBS液离心洗涤2次，用70%冷乙醇(4℃)固定;调整细胞浓度为1.0×106/ml，取1 ml单细胞悬液，加入兔抗人 Survivin抗体0.1 ml(工作浓度1∶50)，室温孵育30 min，PBS液洗3次;分别加入羊抗兔IgG二抗工作液100 μl，避光室温孵育30 min，PBS液洗3次后上机检测。设PBS代替一抗和二抗的阴性对照，以及只加二抗的本底对照。以荧光指数(FI)表示蛋白表达的相对含量。均道值(平均荧光强度)=lg(测量值)×340。FI=实验样品均道值/对照样品均道值。

1.3.3 RT-PCR法半定量检测细胞的Survivin mRNA表达 取对数生长期细胞，各组均重复3瓶。用Trizol提取总RNA，电泳进行总 RNA完整性检测。各取2 μl测其260 nm和280 nm光密度值(OD260 nm和OD280 nm)，比值在1.8～2.0之间，说明RNA纯度较高，可进行下一步检测。将各组RNA标本逆转录生成cDNA，PCR反应检测各组细胞Survivin基因的转录情况。以GAPDH作为内参，片段长度为452 bp，上游引物5'-ACCACAGTCCATGCCATCACT-3'，下游引物5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。反应条件为94℃ 5 min，94℃ 1 min，64℃ 40 s，72℃ 30 s，循环35次。设计 Survivin片段大小为447 bp，上游引物 5'-GCATGGGTGCCCCGACGTTG-3'，下游引物5'-GCTCCGGCCAGAGGCCTCAA-3'，反应条件为 94℃ 2 min，94℃ 45 s，68℃ 45 s，72℃ 1 min，循环35次。上述PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳。应用1D Image Analysis Software进行表达强度分析，同时以GAPDH作为内参照。相对系数=细胞PCR产物表达强度/GAPDH表达强度。

1.4 统计学分析 采用SPSS11.0统计软件包，计量资料以±s表示，符合正态分布的计量资料组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 各组FCM检测细胞增殖的比较 与对照组相比，化疗组各细胞周期无明显变化(P＞0.05)。热疗组、热化疗组G0/G1期的细胞比例逐渐提高，而S期的细胞比例明显降低(P＜0.05)。与对照组及化疗组相比，热疗组G2/M其细胞比例增多，但不具有显著性(P＞0.05)。热化疗组相比各组各期细胞比例变化均具有显著性差异(P＜0.05)。与对照组相比，化疗组、热疗组PI虽然有所降低，但无显著性差异(P＞0.05)，而热化疗组与各组相比PI明显降低(P＜0.05)。见表1。

2.2 各组细胞Survivin蛋白表达的比较 对照组、化疗组、热疗组、热化疗组Survivin FI值分别为:1.000±0.000，1.011±0.016，0.736 ±0.008，0.629 ±0.022。与对照组相比，化疗组 FI值无显著性差异(P＞0.05)，而热疗组、热化疗组的GST-π蛋白表达的FI值逐步降低，并均具有显著性差异(P＜0.01)。

表1 各组细胞周期及PI变化(±s，%，n=3)

表1 各组细胞周期及PI变化(±s，%，n=3)

1)与对照组比较;2)与化疗组比较;3)与热疗组比较:均P＜0.05

组别 G0/G1 S G2/M PI对照组 43.81±2.11 40.30±0.80 15.89±2.56 84.11±2.56化疗组 43.65±2.28 40.38±0.77 15.97±3.04 84.03±3.04热疗组 48.20±0.291)2)34.50±1.501)2) 17.30±1.79 82.70±1.79热化疗组 61.16±1.651)2)3)16.68±0.851)2)3)22.16±2.311)2)3)77.84±2.321)2)3)

2.3 各组细胞的Survivin mRNA表达的比较 对照组、化疗组、热疗组、热化疗组 Survivin mRNA半定量值分别为:15.367 ±0.702，15.833 ±0.702，7.600 ±0.436，5.600 ±0.500。与对照组相比，化疗组无显著差异(P＞0.05)，而热疗组、热化疗组Survivin mRNA表达逐步降低，并均有极显著差异(P＜0.01)。

3 讨论

MDR的产生归因于许多因素，包括细胞内药物外排及胞内药物重分布、启动细胞内解毒系统、拓扑异构酶II蛋白含量及活性下降，DNA的修复损伤能力增强、细胞抗凋亡机制的参与等。

热诱导细胞凋亡是热疗杀伤肿瘤细胞的主要机制〔2，3〕。Zhang等〔4〕研究显示奥沙利铂对肿瘤细胞的生长抑制作用具有温度依赖性，发现在50 μg/ml的奥沙利铂作用下，43℃对肿瘤细胞的抑制作用最强。并且研究表明热疗可引起G0/G1期细胞周期阻滞，并通过上调P53，Bax表达和下调 Bcl-2来促进Lovo细胞凋亡。Walther等〔5〕通过体内外41℃ ～43℃加热处理人类结肠癌细胞HCT15和HCT16后，运用酶联免疫吸附试验测定热疗前后TNF-α和多药耐药基因抑制基因(CAT)的表达，结果表明TNF-α分泌和CAT表达显著增强，P糖蛋白(P-gp)、多药抗药性相关蛋白(MRP)和肺多药抗药性相关蛋白(LRP)表达均显著减弱，这在一定程度上提示，热化疗可以抑制P-gp和MRP表达，逆转肿瘤多药耐药性。

本研究发现热疗及顺铂联合热疗都可以使人胃癌耐药细胞SGC7901/DDP的G0/G1期细胞增多，S期细胞减少，G2/M期细胞相对增多，并且顺铂联合热疗作用效果最明显。这可能是热疗将细胞抑制于G1期，而G1期正是化疗药物作用的敏感点〔6〕，所以逆转了耐药肿瘤细胞对化疗的敏感性。

Survivin是细胞凋亡抑制蛋白(IAP)家族的新成员，具有抑制细胞凋亡的作用，在肿瘤的形成过程中起着关键的作用〔7〕。它广泛表达于人的胚胎组织和各种肿瘤组织，但在正常成人分化组织中(胸腺、生殖器除外)检测不到。Survivin mRNA在细胞周期中的G2/M期特异性高表达，其过度表达若超越细胞自身的周期调控时，就会导致肿瘤的形成;相反，Survivin基因缺失的细胞也不能正常进行细胞分裂〔8，9〕。多项研究发现〔10，11〕，抑制Survivin的表达可以抑制肿瘤细胞的增殖，并且能够增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。

本研究中，单纯热疗及顺铂联合热疗作用后，SGC7901/DDP细胞中Survivin蛋白及mRNA的表达明显的下降，并且并顺铂联合热疗作用后下降最明显。由此推测，热疗可能通过抑制Survivin蛋白的生成及Survivin mRNA的表达，来增强耐药肿瘤细胞对化疗的敏感性。

综上，热疗联合顺铂化疗对人胃癌耐药细胞SGC7901/DDP具有明显的抑制作用，然而肿瘤耐药的机制是复杂的，热疗逆转肿瘤耐药的机制需要进一步研究。

1 董 倩，陈 虎，孔 雁，等.肿瘤热化疗研究进展〔J〕.肿瘤研究与临床2009;21(7):499-501.

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3 Ashush H，Rozenszajn LA，Blass M，et al.Apoptosis induction of human myeloid leukemic cells by ultrasound exposure〔J〕.Cancer Res，2000;60(4):1014.

4 Zhang XL，Hu AB，Cui SZ，et al.Thermotherapy enhances oxaliplatin-induced cytotoxicity in human colon carcinoma cells〔J〕.World J Gastroenterol，2012;18(7):646-53.

5 Walther W，Stein U，Schlag PM.Use of the human MDR1 promoter for heat-inducible expression of therapeutic genes〔J〕.Int J Cancer，2002;98(2):291-6.

6 Shao J，Lee SB，Guo H，et al.Prostaglandin E2 stimulates the growth of colon cancer cells via induction of amphiregulin〔J〕.Cancer Res，2003;63(17):5218-23.

7 Altieri DC.Survivin and IAP proteins in cell-death mechanisms〔J〕.Biochem J，2010;430(2):199-205.

8 Wen YZ，Zhao NJ，Zhi NY，et al.Survivin siRNA inhibits gastric cancer in nude mice〔J〕.Cell Biochem Biophys，2012;62(2):337-41.

9 Kelly RJ，Lopez-Chavez A，Citrin D，et al.Impacting tumor cell-fate by targeting the inhibitor of apoptosis protein survivin〔J〕.Mol Cancer，2011;10:35.

10 方 雷，吴海滨，陈晓岗.Survivin基因沉默抑制胃癌MGC-803细胞增殖并增强其对塞来昔布的敏感性〔J〕.南方医科大学学报，2011;31(11):1944-8.

11 Shen X，Zheng JY，Shi H，et al.Survivin knockdown enhances gastric cancer cell sensitivity to radiation and chemotherapy in vitro and in nude mice〔J〕.Am J Med Sci，2012;344(1):52-8.