气相色谱－质谱联用法测定14种食用植物油中的植物甾醇

杨春英 刘学铭 陈智毅 杨荣玲 林耀盛 赵晓丽

(广东省农产品加工公共实验室广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所/农业生物技术研究所，广州 510610)

植物甾醇(Phytosterol，plant sterol)是一种天然的植物活性物质，广泛存在于各种植物油、种子和坚果中，也存在于部分蔬菜水果中［1］。植物甾醇的结构与胆固醇相似［2］，为环戊全氢菲的3－羟基化合物，C－5上有双键的称甾醇，C－5饱和的称甾烷醇。常见4种植物甾醇为豆甾醇、β－谷甾醇、菜籽甾醇和菜油甾醇，其化学结构如图1所示。四种甾醇的区别在于支链大小和双键数目不同。

图1 4种植物甾醇结构式

研究证明，植物甾醇具有降血脂［3－4］、防治前列腺肥大、抗肿瘤、类激素、提高免疫力等多种生理功能［5］，在西方很多国家将其应用于人群慢性病预防。近20年来，国内外学者日益重视植物甾醇的研究，开展了食物中植物甾醇的含量测定及功能评价工作，并将其作为功能食品的一种添加剂［6－7］。传统测定植物甾醇的方法如重量法、比色法及酶法等，只能测定甾醇总量，不能实现对具体某一甾醇进行定性和定量分析［8］;近年报道的方法主要有薄层色谱法［9］(TLC)、高效液相色谱法［10］(HPLC)、气相色谱法［11］(GC)和气相色谱 － 质谱法［12］(GC － MS)等。由于GC法具有快速简便、灵敏度高和分离效果好等优点，再加上MS的定性效果较好，故本试验在前人研究的基础上，优化了食用植物油中甾醇测定的GCMS法，样品皂化后无需衍生，可直接进样分析。同时对14种食用植物油的4种植物甾醇含量进行了分析，为合理选用食用油和食用油品质评价提供了依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

油茶籽油、花生油、葡萄籽油、芝麻油、大豆油、菜籽油、玉米油、葵花籽油、橄榄油、花椒籽油、辣椒油、芥末油、姜油和大蒜油:市售，其中，花椒籽油、辣椒油、芥末油、姜油和大蒜油均为以植物油为基础添加辛香料的调味油。

豆甾醇、β－谷甾醇、菜籽甾醇和菜油甾醇标准品:美国Chromadex公司;色谱纯无水乙醇，优级纯氢氧化钾和无水硫酸钠，其余试剂均为分析纯，所用水为超纯水。

6890N/5975B气相色谱－质谱联用仪:美国Agilent Technologies有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 分析条件

1.2.1.1 气相色谱条件

色谱柱:J＆W DB－5MS UI毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm);进样口温度:300 ℃;进样量:1.0 μL，分流比为 20∶1;载气:高纯氦气，流速为 1.0 mL/min;程序升温:初始温度180℃，以15℃/min升温速率升至280℃，保持25 min。

1.2.1.2 质谱条件

EI离子源，电子能量70 eV;离子源温度230℃;四极杆温度计150℃;传输线温度280℃;质量范围30～550 amu，全扫描方式;溶剂延迟2 min。

1.2.2 样品处理

准确称取2.000 0 g植物油于100 mL具塞三角瓶中，分别加入30 mL无水乙醇，2.5 mL 20% 抗坏血酸溶液，3.00 mL50%氢氧化钾溶液，置80℃水浴边加热边震荡40 min使其皂化，皂化完全后立即将皂化试液放入冰水浴中冷却。将皂化试液转移至250 mL分液漏斗中，用40 mL超纯水分3次洗涤皂化用的三角瓶，洗液并入分液漏斗中。加入40 mL乙醚萃取，重复3次，合并乙醚萃取液，用超纯水洗涤至中性，过无水硫酸钠除去残留水分。萃取液于50℃水浴中减压浓缩并回收乙醚，残渣用少量乙醚洗至5 mL带刻度试管中，氮气吹干，残留物用2.00 mL无水乙醇复溶，经0.22 μm微孔滤膜过滤后进GC－MS分析。

1.2.3 定性和定量分析

植物甾醇的定性方法采用保留时间、标准品比对和质谱库检索(NIST05a.L)方法;定量分析采用外标法，依据总离子流图峰面积计算每种植物甾醇的绝对含量。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线和检测限

分别准确称取一定量上述4种植物甾醇标准品，加入无水乙醇溶解，10 mL棕色容量瓶定容，配制成标准储备液，再逐级稀释配制成系列标准工作液。按照上述分析条件进行检测。以峰面积Y对植物甾醇浓度X进行线性拟合，检出限按S/N=3计算，结果见表1和图2。可见，在本试验条件下，4种植物甾醇在选定的浓度范围内具有的线性关系(R≥0.999 2)，方法检测限(分流进样)均在8.62 mg/L以下，采用不分流进样检测限将更低。

表1 4种植物甾醇曲线方程及检出限(浓度范围20～500 mg/L)

图2 4种植物甾醇标准曲线

2.2 精密度和回收率

为检验该方法对实际样品的适应性，采用标准品加入法。按上述方法测定，对选取的植物油样品进行了加标回收试验，每种水平分别做7份平行试验，计算平均回收率和相对标准偏差，4℃冰箱放置24 h后再测定，计算其日间变异系数，结果见表2。结果表明，标准加入的回收率较高(89.4%～106.8%)，RSD小于5.50%，24 h内测定结果无显著变化。

表2 加标回收试验结果(n=7)

2.3 皂化条件的确定

试验在参考国内外研究基础上［13－15］，选用50%氢氧化钾和无水乙醇混合液对样品进行皂化。试验选取花生油为代表，考察了不同的皂化温度(65、70、75、80、85 ℃)、皂化时间(35、40、50、60 min)及皂化剂用量对花生油皂化程度的影响，结果表明:样品在80℃水浴条件下，皂化40 min即可皂化完全，无水乙醇和50%氢氧化钾溶液用量分别为30.00 mL和3.00 mL。

2.4 最佳色谱分离条件

J＆W DB－5MS UI毛细管色谱柱具有超高惰性，特别低的色谱柱流失，对难以分离的活性化合物有良好的峰形。研究选用J＆W DB－5MS UI毛细管GC柱，考察了进样口温度、进样模式、分流比、初始温度及升温程序的影响，最终确定1.2.1所述分析条件，可在32 min内实现植物甾醇与其他不皂化物的分离，如图3所示。可见，本研究建立的方法可实现待测组分和干扰组分的良好基线分离。

图3 玉米油不皂化物总离子流图

2.5 植物油样品中甾醇的测定与分析

利用上述方法，对市售14种食用植物油中的4种植物甾醇进行了分析，结果见表3。

由表3可知，植物油种类不同，其4种植物甾醇的含量、比例以及总量各不相同。大多数植物油中β－谷甾醇质量分数居高，在47.5%～89.4%之间，其中，β－谷甾醇以橄榄油的质量分数最高，达89.4%;其次为菜油甾醇，10.6%～54.5%之间，其中以菜籽油含量最高，占4种植物甾醇总量的54.5%，高于β－谷甾醇含量。同一种类不同品牌的植物油中4种植物甾醇比例基本接近，说明植物甾醇含量比例关系主要取决于原料，这与文献报道一致［11］;但总量存在一定的差异，可能与生产工艺、精炼方法、储藏条件及原料品种等多种因素有关。

在纯品植物油中，菜籽油和玉米油的4种植物甾醇总量最高，约5 000 mg/kg，其次是芝麻油;茶油和橄榄油的植物甾醇含量最低，这与该植物油不皂化物含量(≤1.5%)低有关;除玉米油和菜籽油外，其余植物油中均未检测到菜籽甾醇;茶油中的豆甾醇含量较高(26.9%～28.4%)，高于菜油甾醇，其余植物油中质量分数均小于15%;根据国际食品法典标准［16－17］对各种植物油甾醇总量和组成范围规定，4种植物甾醇的含量及其总量基本在规定范围内，可见，采集的样品真实性和可靠性强，测定结果准确性高。

表3 植物油甾醇含量测定结果(n=3)

5种调味油中姜油的甾醇含量最高，与玉米油和菜籽油含量接近，辣椒油和芥末油含量基本一致，由于原料同时含有植物甾醇，未能推测调味油中的植物甾醇来源于原料或者选用的植物油。

除上述4种植物甾醇外，同时检测到少量其他植物甾醇(图4，括号内数值表示相似度)，主要包括麦角甾烷醇、羊毛甾醇、豆甾二烯醇、禾本甾醇、α－香树脂醇、Δ7－豆甾烯醇、环阿屯醇。鉴定依据NIST05a.L质谱库检索，以相似度 ＞85(最大值为100)确认为该物质。由图可见，不同植物油其植物甾醇组成不同，由于试验条件限制，缺乏标准品，暂未能对上述7种植物甾醇进行准确定量分析。

图4 玉米油和葵花籽油总离子流图片段

2.6 聚类分析

以4种植物甾醇绝对含量为变量、以平方欧氏距离为度量准则、以组间连结法(between－group linkage)为组群合并准则，用SPSS19.0软件对14种25个植物油样品进行了系统聚类分析。结果见图5。

图5 植物油基于植物甾醇组成的聚类树状图

图5的分析结果表明:不同品牌的同一种植物油均可归为同一类别，说明同种植物油的植物甾醇组成相似，与直观的结果分析一致。经过聚类分析后，橄榄油独为一类，其植物甾醇组成与其他植物油之间存在明显的差异;其余13种植物油可分为两大类:其中菜籽油独为一类，说明其与组内其他样本差异较大，葡萄籽油等12种23个植物油样品为第二大类，说明组内植物油的植物甾醇组成具有相似性。第二大类中茶油并未归为任何亚类中，说明其与所在大类中其他样本存在一定差异性，其余11种植物油又可分为两大亚类，花生油、芝麻油、葵花籽油和葡萄籽油为第一亚类;玉米油等7种植物油为第二亚类。第一亚类又可细分为两小类，8个品牌花生油为一类，说明花生油与第一亚类组内的其他成员既有相似性又有所差别。姜油、大蒜油、芥末油、花椒油和辣椒油均为调和油，其植物甾醇组成与花生油、芝麻油等纯品植物油存在差异，故划分为同一类别，玉米油和大豆油经聚类后与上述调和油划分为同一大类，说明组内成员之间有相似之处，分析其原因可能是调和油的配料组成不明确，选用的植物油可能是一种或多种。

3 结论

本研究建立了GC－MS测定食用植物油中植物甾醇含量的方法，并对常见14种食用植物油中的4种植物甾醇进行了分析，方法准确度高，重现性好、适用性强，通过保留时间和质谱定性，可准确地测定植物甾醇的含量。通过系统聚类和直观分析，初步认为不同品牌的同种植物油的4种植物甾醇比例具有一致性，为食用油的品质鉴定和营养评价提供了科学依据，同时为消费者的膳食合理搭配提供了参考，人们可根据自身需要，选用合适的植物油来增加总植物甾醇或某种植物甾醇的摄入量，以达到预防疾病的作用。

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