籽瓜种子蛋白质组成及其提取工艺优化的研究

张 超 郭晓飞 李 武 马 越 王 丹 赵晓燕

(北京市农林科学院蔬菜研究中心农业部华北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室农业部都市农业(北方)重点实验室，北京 100097)

籽瓜(Citrullus vulgaris L.)，又名打瓜，属葫芦科一年生草本植物，原产地为非洲西南部卡拉哈迪沙漠中。我国籽瓜种植主要分布在甘肃、内蒙、新疆等地区，年产量超过百万吨［1］。籽瓜种子蛋白质含量为36% ～40%，其必需氨基酸除赖氨酸外均达到或超过FAO(联合国粮农组织)推荐的标准［2－3］，是一种优良的植物蛋白资源。研究表明籽瓜种子蛋白质除了可作为人体外源性蛋白质优良补充剂外，其还可以高效螯合锌离子和铁离子，从而帮助人体补充矿物质［4］。近年来，花生［5］、椰子［6］、杏仁［7］和沙棘［8］等的蛋白质均采用碱溶酸沉法的取得良好的提取效果，而籽瓜种子的研究主要集中在促进其萌芽方法及其健康生产的研究，仅张玉秀等［2］对其氨基酸和脂肪酸组成进行了系统的评价和比较。

本研究在前人的基础上，对民籽1号籽瓜种子蛋白质的基本组成进行分析，评估其氨基酸组成;并利用响应面分析的方法优化其蛋白质提取工艺，通过回归模型对提取工艺进行预测，获得最优工艺条件，为其后续对籽瓜种子蛋白质的功能评价、功能肽的研究奠定夯实基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

籽瓜种子:民籽1号，甘肃省民勤县金谷源农业科技有限公司;大豆、花生、葵花籽:市售;乙醚沸程(30～60℃)，氢氧化钠，浓盐酸，硫酸铜，硼酸，酒石酸钾钠均为分析纯(AR):北京化工厂;酪蛋白:北京奥博星生物技术有限公司;福林酚试剂:美国Sigma公司。

1030 Analyzer凯氏定氮仪:瑞士 Tetator公司;FE20pH计:瑞士Mettler Toledo公司;3－18K冷冻离心机:德国Sigma公司;UV－1800紫外可见分光光度仪:日本岛津公司;ALPHA2－4LD冷冻干燥机:德国Chirst公司。

1.2 籽瓜种子组成检测方法

蛋白质含量测定依据 GB/T 5009.5—2010采用凯氏定氮法;提取液中蛋白质采用福林－酚比色法测定［9］;粗脂肪含量测定依据 GB/T 14772—2008采用索氏提取法进行测定;水分含量依据GB/T 5009.3—2010采用常压干燥法进行测定;灰分含量测定依据GB/T 5009.4—2010采用干法灰化法测定;氨基酸组成参考GB/T 5009.124—2003采用氨基酸自动分析仪法测定。

1.3 脱脂籽瓜种子粉的制备

利用万能粉碎机对籽瓜种子进行粉碎处理，然后按1∶4的比例使用乙醚对籽瓜种子脱脂，脱脂温度为50℃，时间为8 h;然后把籽瓜种子粉置于通风橱中干燥8 h，再置于鼓风干燥机50℃干燥12 h。

1.4 籽瓜种子蛋白质的提取工艺

籽瓜种子粉按1∶10加入去离子水，调节pH值(0.5 mol/L 的 HCl或 0.5 mol/L 的 NaOH)，在水浴中搅拌，3 500 r/min下离心15 min，调节上清液至pH 5.0(预试验证明籽瓜种子蛋白质的等电点在pH 5.0附近)，离心弃去上清液得洗沉淀，调节体系至pH 7.0，冷冻干燥获得籽瓜种子蛋白质。蛋白质的提取率采用公式1进行计算。

1.5 单因素试验设计

在温度为35℃，时间60 min，考察不同pH值(8、9、10、11和12)对蛋白质提取率的影响;在pH为11，时间为 60 min，考察不同温度(25、35、45、55 和65℃)对蛋白质提取率的影响;在 pH 11，温度为55 ℃，考察不同时间(30、45、60、75 和 90 min)对提取率的影响。

1.6 响应面试验设计及其验证性试验

利用Box－Beknhen中心组合试验设计原理，选取pH、温度和浸提时间3个主因素，设计3因素3水平响应面试验，考察不同因素水平对蛋白质提取率的影响。因素水平表见表1。以响应面得到的最佳工艺条件提取籽瓜种子蛋白质，考察实际提取率与预测值之间的差异。

表1 响应面试验设计因素水平表

1.7 统计分析

利用Oring 8.0(美国Origin Lab公司)对单因素试验数据进行图像绘制;采用Design－Expert V8(美国Stat－easy公司)进行中心组合试验设计，并利用此软件进行F检验，考察各因素及交互作用的显著性，置信区间为95%。

2 结果与讨论

2.1 籽瓜种子组成分析

表2为籽瓜种子、大豆、花生和葵花籽的基本成分分析结果，籽瓜种子蛋白质为36.2%，高于其他3种作物。同时其脂肪含量为45.7%，高于大豆。Wani等［10］测定籽瓜种子常规成分，粗蛋白和粗脂质含量分别为16.34%和21.93%，二者的差异较大，产生的原因可能在于籽瓜的品种、生长气候和环境所造成的。

表2 籽瓜种子、花生、大豆和葵花籽基本成分分析

表3为籽瓜种子、大豆、花生和葵花籽的必需氨基酸组成分析结果，籽瓜种子蛋白中富含人体必需氨基酸，从必需氨基酸含量来看，大豆的最高，其次为籽瓜种子、葵花籽和花生，它们的含量分别为13.8%、11.6%、10.1% 和 9.11%，籽瓜种子的氨基酸组成与大豆的氨基酸组成较相似，但几种作物必需氨基酸含量显著低于FAO/WHO(1973 FAO规定标准)的必需氨基酸均衡模式，但籽瓜种子蛋白必需氨基酸配比适宜;籽瓜氨基酸组成与张玉秀等研究结果存在一定差异，可能在于不同品种及生长的环境所造成的［2］。

表3 必需氨基酸组成分析

2.2 pH对籽瓜种子蛋白质提取率的影响

料液比对蛋白质提取率影响不明显，因而试验均采用1∶10的料液比。图1显示不同pH对籽瓜种子蛋白质提取率的影响(料液比为1∶10，提取温度为35℃，时间为60 min)。提取率随pH的提高呈上升的趋势，当pH达到11时，蛋白质的提取率趋于稳定。在pH 11时，蛋白质的提取率达到50.7%。籽瓜种子蛋白主要为球蛋白［11］，因而随着环境pH的提高，球蛋白从籽瓜种子组织中扩散出来［12］;随着体系氢氧化钠浓度的提高可能会对蛋白质有一定的裂解作用［13］，因而促使pH 12时的提取率略小于 pH 11的体系。选定pH 11为响应面分析的中心点。

图1 pH对蛋白质提取率的影响

2.3 温度对籽瓜种子蛋白质提取率的影响

图2 显示温度对蛋白质提取率的影响(料液比为1∶10，pH 11，浸提时间为60 min)。随着浸提温度的提高，提取率呈明显的上升趋势，在浸提温度达到55℃时，蛋白质提取率可达61.2%;温度的升高加速分子间的扩散，获得更多的蛋白质，同时也会使蛋白质变性，影响提取率［8］。在西红柿种子蛋白［14］、花生蛋白质［15］、南瓜子蛋白质［16］和沙棘蛋白质［8］制备过程中，都呈现出随温度升高提取率先升高后下降的趋势。因此选定55℃为中心组合试验的中心点。

图2 温度对蛋白质提取率的影响

2.4 时间对籽瓜种子蛋白质提取率的影响

图3 显示时间对蛋白质提取率的影响(料液比为1∶10，pH 11，浸提温度为55℃)。随着时间延长，蛋白质的提取率呈上升趋势，当浸提时间达到75 min时，逐渐趋于动态的平衡;继续提高浸提时间，对提取效率影响不大。考虑到节约成本、降低能源消耗，选择75 min为宜。

图3 浸提时间对提取率的影响

2.5 响应面分析结果

进一步采用Box－Beknhen中心组合试验优化蛋白质工艺参数，并用二次方程来表征因素水平与响应值之间的数学模型:

式中:Y 为测定的响应值;b0、bi、bii和 bij为二次回归模型中的常数项;Xi、Xj为不同变量的水平。其中每一个因素可分为线性部分、二次项部分和交互项部分，用来评估回归方程的拟合效果，通过F检验考察各因素及交互作用的显著性［17］。表4为试验设计及其对应的提取率。

表4 响应面试验设计方案及结果

利用Design Expert软件对自变量编码进行回归分析，得如下回归方程:Y=0.64+0.016X1+0.012 X2+8.175E －003X3－5.500E －003X1X2－5.100E －003X1X3－3.750E －003X2X3－0.013X12－6.655E －003X22－0.012X32。并利用 Design－Expert软件进行F检验，考察各参数及其交互作用对试验结果影响的显著性程度。此回归模型的变异系数和决定系数分别为1.46%和92.69%，表明该预测模型可较好反应试验的真实情况;由方差分析表(表5)可知，时间对提取率的影响显著(P＜0.05)，且温度和pH对提取率影响极显著(P＜0.01);但温度与浸提时间，温度与pH和pH与时间交互作用对试验结果的影响不显著;由方差分析表可知，各因素对试验结果的影响程度依次为pH＞温度＞时间。

表5 回归模型的方差分析

响应面图可以直观的反映不同因素对响应值的影响［18］，图4～图6分别表示不同因素交互作用提取率的影响，比较图4～图6可知，温度和pH的交互作用的响应面图最为陡峭，其次为时间与pH的交互作用;图像的陡峭与否可以直观放映各因素对试验的影响程度［19］。利用Design－Expert软件对二次回归模型进行求解，获得最优提取率为66.8%，把应的编码值其转化为实际值，即pH 11.5、浸提温度61.5℃、时间 77.0 min。

图4 温度与pH的交互作用对提取率影响的响应面图

图5 时间与pH的交互作用对提取影响的响应面图

图6 时间与温度的交互作用对提取率影响的响应面图

2.6 验证性试验

为考察数据的真实性，采用相应面优化的最佳提取条件对籽瓜种子蛋白质进行提取，试验重复3次，其蛋白质提取率平均值为64.5%，与预测值的相对误差仅为3.44%，该模型准确、可靠。

3 结论

对籽瓜种子的基本组成和氨基酸组成进行评价，表明籽瓜种子为优良蛋白质资源;利用单因素和中心组合试验，获得其蛋白质的最佳提取工艺为pH 11.5、温度61.5 ℃和时间77 min，该模型准确、可靠，可为后续研究提供基础数据。

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