响应面分析法优化大血藤中总酚的超声提取工艺

马瑞丽， 张 蓉， 徐秀泉， 汤 建， 汪占弟， 欧阳臻*

(1．江苏大学药学院，江苏镇江212013;2．兰州市动物疫病预防控制中心，甘肃兰州730050)

大血藤为大血藤科植物大血藤Sargentodoxa cuneata(Oliv.)Rehd.et Wils.的藤茎，别名红藤、红皮藤、大活血等，主产于安徽、浙江、江西、湖北、广西等地。具有清热解毒、理气活血、祛风杀虫、消肿散结、止痛、通经、败毒等功效［1］。近年来药理活性研究表明大血藤具有较强的抗氧化、抗菌以及抗炎免疫活性，临床用以治疗阑尾炎、月经不调、崩漏、肠痈腹痛、经闭痛经、风湿痹痛、跌打肿痛等。化学研究表明大血藤含有大量酚酸类物质［2-5］，推测其为主要药效活性成分之一。而酚酸类物质作为一类具有独特生理和药理活性的天然产物，具有较强的抗氧化作用，在抑菌、抗肿瘤、防衰老和抗炎免疫等方面都具有良好的功效［6-7］。Li等［8］研究了45种植物的抗氧化活性，发现大血藤甲醇提取物具有较高的抗氧化活性，并且总酚质量分数为52.35 mg/g，高于其它44种植物。大血藤有降低佐剂性关节炎大鼠异常升高的TNF-α，IL-6水平，减轻局部炎症的作用，可能与富含的多酚类成分有关［9-10］。但目前对大血藤总酚提取工艺的研究鲜有报道，本实验首次研究了采用超声提取法提取大血藤中总酚的提取工艺，应用响应面法 (response surface methodology，RSM)对超声波提取工艺进行优化，为大血藤中总酚酸的进一步开发和综合利用提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 KQ—250 DB型数控超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司)，UV—2550型紫外-可见分光光度计 (日本岛津公司)，BS—110S型电子天平 (北京赛多利斯仪器系统有限公司)，DHG—9145型鼓风干燥箱 (上海一恒科技有限公司)，HH—S2数字恒温水浴锅 (金坛市医疗仪器厂)，高速中药粉碎机 (瑞安市永历制药机械有限公司)，S-2药典检验筛 (浙江上虞市华康化验仪器厂)。

1.2 试药 大血藤药材购于安徽亳州药材市场，经鉴定为大血藤科植物大血藤Sargentodoxa cuneata Rehd．的藤茎。没食子酸对照品 (批号:110831-200803)购自中国药品生物制品检定所，Folin-Ciocalteu试剂自制，其余试剂均为国产分析纯，实验用水为蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 总酚的测定 总酚测定参照文献［11］，采用Folin-Ciocalteu法测定，略有改进，以没食子酸为标准品绘制标准曲线。

2.1.1 对照品溶液的制备 准确称取没食子酸标准品5.0 mg，置于100 mL量瓶中，蒸馏水溶解并定容至刻度，摇匀，即得50μg/mL没食子酸标准溶液，低温保存备用。

2.1.2 标准曲线绘制 精密吸取没食子酸对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，分别置于10 mL量瓶中，分别加入6 mL蒸馏水，混匀，加入0.5 mL Folin-Ciocalteu试剂，混匀，0.5～8 min内加入1.5 mL 20%Na2CO3溶液，加蒸馏水定容至10 mL，混匀。75℃水浴10 min，以空白试剂调零，在760 nm波长下测定吸光度。每个浓度做3个平行试验，取平均值，作标准曲线。以吸光值为纵坐标，总酚质量浓度为横坐标进行线性回归分析，得回归方程为:Y=0.117 4X+0.013 9，r=0.999 6。结果表明，质量浓度在1～7μg/mL范围内线性关系良好。

2.1.3 供试品溶液的制备 准确称取过《中国药典》2号筛的干燥大血藤粉末适量，每份1 g，超声提取之前加适量溶剂浸泡1 h，按单因素条件及表2中Box-Behnken试验设计超声提取 (通过加少量冷水控制温度)。精密吸取各提取液的上清液300μL，蒸馏水定容至25 mL，摇匀，过滤即得。

2.1.4 供试品总酚量测定及总酚得率计算 精密吸取上述供试品溶液1 m L，按2.1.2项下操作方法测定吸光值，每个样品重复3次，并根据回归方程计算提取液质量浓度，计算总酚得率。

2.2 提取工艺筛选

2.2.1 单因素实验 根据预实验结果，本实验考察了含乙醇量 (40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%，n=3)、提取温度 (30、40、50、60、70℃，n=3)、料液比 (1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30，n=3)、超声时间 (0、20、30、40、50、60 min，n=3)、提取次数 (1次、2次、3次，n=3)对大血藤总酚得率的影响。每次称取1 g大血藤粉末进行实验，取所得提取液的上清液稀释后按2.1.2项下测定吸光值，根据回归方程计算提取液中总酚得率，结果见图1。

图1 单因素试验结果

单因素试验结果表明:含乙醇量、提取温度和提取时间对提取效果的影响较大;随着料液比的增大，总酚得率在1∶10～1∶20缓慢增加，在料液比为1∶25时有最大值，之后随料液比的增加，总酚得率反而降低;并且超声提取一次总酚得率为9.85%，提取两次总酚得率为10.15%，即提取一次几乎可以将总酚类物质完全提取。从经济效益方面考虑，本实验选择料液比为1∶25，超声提取一次即可。

2.2.2 响应面分析因素水平及结果 根据单因素试验确定的初步结果，采用响应面分析法中Box-Behnken的中心组合实验设计原理，以含乙醇量 (A)、提取温度 (B)和提取时间 (C)3个因素为自变量，每个因素取3个水平，分别以-1、0、1编码，以总酚得率为响应值，含乙醇量60%、提取温度60℃、提取时间30 min为中心点施行响应面分析，进行3因素3水平试验。因素水平见表1，结果见表2。

表1 响应面分析因素水平

2.2.3 响应面分析结果 使用统计软件Design Expert 8.05b对表2中总酚得率数据进行多元回归拟合，得到总酚得率对编码自变量A、B和C的二次多项回归方程:Y=10.59－0.34A+0.020B+0.51C－0.46AB+0.25AC－0.053BC－0.47A2－0.48B2－0.61C2。方差分析及回归系数显著性检验结果见表3，回归方程可信度分析见表4。

表2 Box-Behnken试验设计与结果

由方差分析可知，此模型极显著 (P＜0.001)，模型决定系数R2=0.962 4及失拟项不显著 (P＞0.5)，说明方程拟合度和可信度均良好，试验误差小，故此模型可用于大血藤总酚提取工艺研究的分析和预测。

表3 方差分析结果

表4 回归方程可信度分析

由表3可以看出，各因素中一次项C是极显著的，其次是二次项C2;A、AB、AC、A2、B2均影响显著，表明各影响因素对总酚得率的影响不是简单的线性关系。一次项B和交互项BC影响不显著，表明提取温度和提取温度与提取时间的交互作用对总酚得率的影响不显著。响应面分析立体图见图2～4。

图2 含乙醇量和提取温度对总酚得率的影响

图3 含乙醇量和提取时间对总酚得率的影响

图4 提取温度和提取时间对总酚得率的影响

由图可知，各因素对总酚得率影响的大小依次为提取时间、提取浓度和提取温度，其中提取时间 (C)的影响最为显著，表现为曲面较为陡峭，而含乙醇量和提取温度次之，表现为曲面较为平滑，且随其数值的增加或减少，响应值变化较小。

根据所得到的模型，可预测在稳定状态下的最大响应值 (Y)为10.735%，对响应面结果利用软件进行优化分析，以总酚得率为评价指标，得到相应的提取工艺优化条件为:乙醇 (A)为56.49%，提取温度 (B)为61.71℃，提取时间 (C)为33.43 min。

2.2.4 验证试验 为检验响应面分析法所得结果的可靠性，采用上述优化条件进行大血藤总酚的提取试验，考虑到实际情况，将修正后的最佳提取条件定为乙醇 (A)为56%，提取温度 (B)为62℃，提取时间 (C)为34 min，提取1次，共进行3次平行试验，得到大血藤总酚平均得率为10.629%(RSD为1.95%)，与理论预测值10.735%的相对误差为－0.99%，与预测值接近，说明此模型可靠。

3 讨论

本实验采用Box-Behnken试验设计法，首次对超声提取法提取大血藤总酚的工艺进行了优化，并建立了二次多项回归模型。此模型极显著，模型决定系数R2=0.962 4及失拟项不显著，可用于大血藤总酚提取工艺研究的分析和预测。优化后确定的大血藤总酚超声提取的最佳工艺条件是含乙醇为56%，料液比为1∶25，在62℃下超声提取时间34 min，提取一次即可。

酚类化合物是该药材的主要活性成分之一，研究其总酚的提取工艺，为该药材的进一步开发提供重要参考。本实验首次报道了采用响应面分析法优化大血藤中总酚超声提取工艺，该工艺大大缩短提取时间，提取充分，能耗低，操作方便，是较为理想的提取总酚的方法。

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