正交设计法优选怀山药软化切制工艺

张华锋， 李晓坤， 杨 云， 张振凌， 石延榜， 杜绍亮

(河南中医学院药学院，河南郑州450008)

山药是薯蓣科植物薯蓣Dioscorea opposita Thunb．的干燥根茎，正宗的山药为河南焦作的怀山药，具有补脾养胃，生津益肺，补肾涩精［1］的功效，是著名的四大怀药之一，在中医临床上应用极为广泛。怀山药含淀粉、蛋白质、游离氨基酸等营养成分以及多糖 (包括黏液质和糖蛋白)、尿囊素、淀粉酶、甾醇类、皂苷类等活性成分［2-9］，在软化切制药材时，泡润过度这些成分就会流失，还给饮片干燥带来困难，泡润不透切片时就会沾刀、易碎。《中国药典》2010年版山药炮制项载“除去杂质，分开大小个，泡润至透，切厚片，干燥”，药典没有规定具体参数，目前关于怀山药软化切制方面的研究也未见报道，而炮制上有“七分润工，三分刀工”的说法，说明切制前的软化是影响饮片质量的一个重要环节［10-12］。本实验通过正交试验设计筛选怀山药软化切制最佳工艺，为怀山药加工生产和质量控制提供参考。

1 材料与仪器

1.1 材料 怀山药“光条”购自河南省焦作市武陟县，经本院生药教研室董诚明教授鉴定为薯蓣科植物薯蓣 Dioscorea opposita Thunb．的干燥根茎;尿囊素对照品 (中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用，编号100431-200401);甲醇为色谱纯 (天津四友)，水为重蒸水，其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器 LC—20A高效液相色谱仪 (日本岛津);METTLER AE240十万分之一精密天平 (瑞士);Sartorious BS224S万分之一精密天平 (北京赛多利斯公司);DZKW—4型水浴锅 (上海东星建材实验设备有限公司);GS101—2D电热鼓风干燥器 (重庆四达实验仪器有限公司)。

2 方法和结果

2.1 尿囊素测定

2.1.1 色谱条件 迪马铂金ODS-C18色谱柱 (4.6 mm×250 mm，0.5μm);流动相为甲醇-水 (97∶3);体积流量0.7 mL/min;检测波长224 nm，柱温25℃，进样量10μL。

2.1.2 对照品溶液制备 取尿囊素约5.2 mg，精密称定，置5 mL量瓶中，加20%甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀作为贮备液 (1.04 mg/mL)。

2.1.3 线性关系考察 取贮备液分别配制成质量浓度为1.04、0.52、0.26、0.13、0.065、0.032 5 mg/mL的溶液，精密吸取10μL注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，以峰面积为纵坐标，进样量(μg)为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为:y=208 328x+11 938(r=0.999 8)，表明尿囊素在0.325～10.4μL间线性关系良好。

2.1.4 精密度试验 精密吸取对照品溶液10μL，连续进样6次，记录峰面积，计算其RSD值为0.17%，表明仪器精密度良好。

2.1.5 重复性试验 精密称取样品6份，按供试品溶液的制备方法处理后，按上述色谱条件进样10μL，记录峰面积，计算尿囊素的量，RSD值为0.38%，表明方法重复性良好。

2.1.6 稳定性试验 精密吸取供试品溶液10μL，分别在2、4、8、12、24 h进样，记录峰面积，计算RSD为0.32%，表明供试品溶液常温下在24 h内稳定。

2.1.7 加样回收率试验 精密称取已知含有量的样品0.5 g，共6份，分别精密加入一定量对照品，其余按供试品溶液制备方法操作制得供试品溶液，精密吸取10μL进样，计算得平均回收率为99.8%，RSD为1.01%(n=6)。

2.1.8 供试品溶液的制备及样品测定 取各干燥样品粉碎，过40目筛，取粉末约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入20%甲醇25 mL，称定质量，超声处理40 min，放冷，再称定质量，用20%甲醇补足减失质量，摇匀，过滤，取续滤液过0.45μm微孔滤膜，再取续滤液即得供试品溶液。分别进样10μL，用外标法计算。

2.2 浸出物测定 浸出物按照2010年版《中国药典》一部附录XA浸出物测定法测定，其中水溶性浸出物采用冷浸法。

2.3 单因素考察

2.3.1 浸泡时间的考察 取大小均匀一致干燥至恒定质量的怀山药400 g，置储水容器中，加约3L水淹没过药面，每隔5 h测定一次吸水量，结果见图1。

吸水量=(浸泡后总药材湿质量－总药材干质量)/总药材干质量×100%

图1 怀山药浸泡吸水率测定结果Fig.1 Determination results of water absorption rate

由图1可见，浸泡时间在16 h之前曲线上升比较平缓，16 h之后曲线上升开始变陡，表明药材内部水分扩散速度加快，有效成分流失应该发生在水分扩散加快过程［4］。

2.3.2 闷润时间考察 取经过浸泡的药材，置密闭的润药缸内，整齐堆放，均匀喷淋清水，经常翻动检查，保持药材湿润状态，直到药材到达内外软硬一致便于切片目的。结果见表1。

表1 闷润时间考察结果Tab.1 Investigation results of moistening time

由表1可见，闷润时间过短不能达到软化切制目的，时间过长容易发霉，也给后期干燥带来困难，结合切片情况用弯曲法看药材的“水性”，药材略弯曲，而不易折断，即为合格。

2.4 因素水平设计及正交实验

2.4.1 因素水平设计 依据《中国药典》2010年版 (一部)附录ⅡD关于药材炮制通则切制项下的有关规定，以浸泡时间、闷润时间、干燥时间、干燥温度为考察因素，每个因素取三个水平，因素水平表如下 (表2)。

表2 怀山药软化切制工艺因素水平Tab.2 Factor-level table of softening and cutting process

2.4.2 正交试验安排 取大小均匀的怀山药“光条”按正交试验表组合平行9份，用清水泡润至便于切片，烘干，得到9个不同条件下的样品，分别编号为1～9。各指标评分方法为:把含尿囊素量最大的样品定位100，其它各样品与该列最大值相比，再乘以100，即得该样品得分，浸出物含有量评分方法相同。确定尿囊素x、水溶性浸出物y、醇溶性浸出物z的权重系数分别为0.4、0.3、0.3，通过公式W=0.4x+0.3y+0.3z，得到综合评分W，正交试验结果见表3，方差分析结果见表4。

表3 正交试验表及结果Tab.3 Results of orthogonal test

表4 方差分析结果Tab.4 Results of variance analysis

直观分析结果，影响因素大小的顺序为:A＞B＞C＞D。方差分析结果表明:A和B因素对试验结果有极显著意义，C因素对试验结果有显著意义，D因素对试验结果无显著意义。结合直观分析和方差分析及生产实际，确定最佳搭配为A1B2C2D1，即怀山药软化切制的最佳方案为:浸泡10 h，后闷润22 h，切片厚度为3 mm，70℃干燥2.5 h。

2.4.3 最佳方案的验证试验 取400 g怀山药“光条”按A1B2C2D1处理，重复3次，试验结果见表5。

表5 验证试验结果Tab.5 Results of verification test

由表5可见，采用优化后工艺进行怀山药的软化切制，其指标性成分含有量都较高，且工艺条件稳定，重复性好。

3 讨论

3.1 《中国药典》2010年版要求山药应切成厚片，药典附录中规定厚片的厚度为2～4 mm，考虑到怀山药粉性的质地，切制过薄在炒制、干燥时易碎边，煎煮时药汁浓度高，影响其他配伍药材的有效成分煎出;过厚则影响药材本身的有效成分煎出，因此本实验的切片厚度定为3 mm。

3.2 本实验选择水溶性浸出物和醇溶性浸出物作为指标，是很有代表性的，因为怀山药中多糖、黏液蛋白、淀粉酶、游离氨基酸水溶性较强;尿囊素和皂苷类成分醇溶性较强。采用多指标综合评判优选怀山药饮片的软化切制工艺条件，符合中药综合作用的特点。

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