高粱米不同溶剂提取物的抗氧化活性研究

刘 禹 段江莲 李为琴 张梅庆 琚裕杰

(山西师范大学食品科学与工程系1，临汾 041004)(临汾市尧都区教育局2，临汾 041004)

高粱(Sorghum bicolor(L.)Moench)属禾本科高粱属一年生草本植物，具有光合效率高、抗逆性强、杂种优势突出、用途广泛等特点［1］。近年来研究发现，高粱中除含有丰富的单宁多酚成分外，还含有酚酸、原花青素、类黄酮等多种酚类化合物［2－3］，这些化合物具有较好的抗氧化活性［2，4］。刘睿等［5］对高粱外种皮的原花青素进行了分离、纯化和抗氧化方面的研究，发现不同提取剂对高粱原花青素的提取率有较大的差异;王华等［6］研究了高粱籽粒的甲醇和水提取物的抗氧化活性;张国涛等［7］研究了不同果皮颜色高粱甲醇提取物的抗氧化活性。这些研究主要以高粱甲醇、乙醇、水提取物为主，并未全面反映高粱籽粒不同溶剂提取物的抗氧化活性。研究结果表明，由于提取溶剂的不同，会导致研究结果上存在一定的差异［5，8－9］。本试验研究了甲醇、80% 甲醇、乙醇、80%乙醇、丙酮、80%丙酮、正己烷、乙酸乙酯、水等不同极性的溶剂对高粱植物化学成分含量及其抗氧化活性的影响，旨在为建立一种有效评价高粱抗氧化能力的方法及高粱米的综合开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料、试剂

脱皮高粱米:农贸批发市场;没食子酸(GA)、芦丁、1，1－苯基 －2－苦肼基自由基(DPPH)、2，2－联氮－3－乙苯－二噻唑－6磺酸(ABTS)、水溶性维生素E(Trolox):sigma公司;Fe3+－三吡啶三吖嗪(TPTZ):Fluka公司;福林酚试剂:西安舟鼎国生物技术有限责任公司;其他药品和试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

TU－1900紫外分光光度计:北京普析通用有限公司;5840R冷冻离心机:Gene公司;SC－5A超级恒温槽:上海比朗仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品制备

将高梁米粉碎，过40目筛。准确称取高粱米粉末2.0 g，放入锥形瓶中。按1∶20料液比分别加入甲醇、80%甲醇、乙醇、80%乙醇、丙酮、80%丙酮、正己烷、乙酸乙酯、水，在30℃水浴振荡器中浸提1 h。然后在4℃、6 000 r/min的条件下离心15 min，取上清液用真空旋转蒸发仪蒸干，用甲醇定容到10 mL，制备所得样品在4℃冰箱中保存，用于样品分析和测定。

1.3.2 多酚含量测定

多酚含量测定采用Folin－Ciocalteu测定法［10］。取0.1 mL样品提取液于试管中，加入2.8 mL蒸馏水和0.1 mL 1.0 mol/L Folin－Ciocalteu 试剂，混合均匀，静止8 min后加入2 mL 7.5% 碳酸钠溶液，摇匀，混合液密封室温下置于避光处，2 h后于765 nm波长测定吸光值，平行测定3次，以甲醇做空白，没食子酸做标准曲线，建立的回归方程为:y=0.002 8x+0.003 5(0 ～200 μg/mL，R2=0.998 9)，式中:y为吸光度值，x为没食子酸浓度(μg/mL)。不同提取物中多酚含量以每克干燥样品中所含的相当于没食子酸的量进行计算。

1.3.3 总黄酮含量测定

精确量取1 mL样品提取液于10 mL的容量瓶中，先加入0.3 mL的5%亚硝酸钠溶液，摇匀静置6 min，再加入0.3 mL的10%的硝酸铝溶液，摇匀静置6 min，然后加4 mL 4%的氢氧化钠溶液，分别用蒸馏水稀释至刻度，静置15～20 min，在波长510 nm下测定吸光值，平行测定3次，以蒸馏水作为空白，芦丁做标准曲线，建立的回归方程为:y=0.011 6x+0.015 1(0～64 μg/mL，R2=0.997 5)，式中:y为吸光度值，x为芦丁浓度(μg/mL)。不同提取物中总黄酮含量以每克干燥样品中所含的相当于芦丁的含量进行计算。

1.3.4 DPPH 自由基清除能力测定［10］

取0.5 mL适当浓度样品溶液和4.5 mL 60 μmol/L的DPPH甲醇溶液，充分混匀后于室温下密封避光静置30 min，以甲醇做空白，于517 nm下测吸光值。DPPH自由基清除率计算公式如下:DPPH清除率=100% ×(A0－A1)/A0，式中:A0为对照管的吸光度值;A1为样品管的吸光度值。以Trolox做标准曲线，建立的回归方程为:y=0.717 3x－1.96(0～140 μmol，R2=0.999 8)，式中:y为清除率;x为 Trolox的浓度(μmol)。样品对DPPH自由基的清除能力以每克样品相当于Trolox的微摩尔数来表示。

1.3.5 ABTS 自由基清除能力测定［11］

使用前将浓度为7 mmol/L的ABTS溶液与2.45 mmol/L过硫酸钾溶液混合，室温避光放置16～24 h，制得ABTS+自由基溶液。用甲醇稀释，制得在734 nm处吸光度为0.700±0.050的应用液。移取50 μL样品溶液，加入1.9 mL的ABTS+应用液，混合，室温下避光反应6 min，立即测定其在734 nm处吸光度。ABTS自由基清除率计算公式为:ABTS+清除率=(A0－A1)/A0×100%，式中:A0为空白管的吸光度值，A1为样品管的吸光度值。以Trolox做标准曲线，ABTS自由基清除能力以每克样品相当于Trolox的微摩尔数表示。

1.3.6 铁还原能力(FRAP)测定［11］

取0.1 mL提取液，加入3.1 mL蒸馏水和新鲜配置的预热37℃的1.8 mL TPTZ工作液(由Ph3.6的300 mmol/L醋酸盐缓冲液，10 mmol/L溶解在40 mmol/L HCl中的TPTZ溶液，20 mmol/L氯化铁溶液按10∶1∶1体积比混合组成)，混匀后在37℃条件下水浴反应30 min，593 nm处测定吸光度。以FeSO4为标准，样品的铁还原能力以每克样品相当于FeSO4的毫摩尔数表示。建立的回归方程:y=0.000 3x－0.008 4(100～100 0 μmol/L，R2=0.996 2)，式中:y为吸光度值;x为FeSO4的浓度(μmol)。

1.4 数据处理

试验所得数据采用Excel处理、DPS统计软件进行单因子方差分析和线性回归分析，以平均值±标准差来表示。

2 结果与分析

2.1 高粱米不同溶剂提取物中总多酚及黄酮含量

高粱米不同溶剂提取物中总多酚及黄酮的含量测定结果见表1。由表1可以看出，用不同组成的溶剂提取高粱米多酚和黄酮物质时，其得率均存在显著性差异。高粱不同溶剂提取液中的总酚含量范围1.30～6.49 mg GA/g。其中80%丙酮与80%甲醇提取液中总酚含量较高，分别为6.49 mg GA/g和6.15 mg GA/g，其次多酚含量由高到低依次为80%乙醇＞丙酮＞甲醇＞乙醇＞蒸馏水＞乙酸乙酯＞正己烷，正己烷提取液中的总酚含量最低(1.30 mg GA/g)，大约是80%丙酮提取液总酚含量的1/5。高粱不同溶剂提取液中的总黄酮含量范围9.6～61.2 mg/100 g。其中80%丙酮提取液中总黄酮含量最高，为61.2 mg/100 g，其次黄酮含量由高到低依次为:丙酮＞80%乙醇＞80%甲醇＞乙醇＞甲醇＞蒸馏水＞乙酸乙酯＞正己烷，正己烷提取液的黄酮含量最低，为9.6 mg/100 g。这些结果说明不同提取剂由于极性、分散性等性质的差异对多酚、黄酮等植物化学成分的提取具有选择性，80%丙酮能有效地提取高粱米中的植物化学成分。Zielinski等［12］也报道80%丙酮是一种从谷物中提取多酚和黄酮成分的有效提取剂，这支持了目前的研究结果。

表1 高粱米不同溶剂提取物中总多酚及黄酮含量

2.2 不同提取物对DPPH自由基的清除能力

高粱米不同溶剂提取物对DPPH自由基的清除能力的研究结果见表2。

表2 高粱米不同溶剂提取物的抗氧化能力

由表2可以看出，不同溶剂提取的高粱米提取物清除DPPH自由基能力存在显著性差异，其中以体积分数80%丙酮的清除率最高，为0.74μmol Trolox/g，说明80%丙酮对高粱米中具有降低羟自由基、烷自由基或过氧化物自由基有效浓度及打断脂质过氧化链作用的成分提取效果较好。其次为体积分数80%甲醇和80%乙醇(二者无显著性差异)，甲醇、丙酮、乙醇、蒸馏水提取物清除DPPH自由基的能力均明显低于80%甲醇和80%乙醇(P＜0.05)，但它们相互之间无显著性差异(P＞0.05);乙酸乙酯和正己烷提取物清除DPPH自由基的效果最差，清除能力分别为 0.09、0.07 μmol Trolox/g。

2.3 多酚、黄酮含量与抗氧化活性的相关性分析

高粱米不同溶剂提取物中多酚、黄酮含量与抗氧化活性的相关性分析结果见表3。由表3可以看出，高粱米提取物多酚含量与抗氧化能力具有极显著的高度正相关性(P＜0.01，0.843甘共苦9＜r＜0.951 3);黄酮含量与清除DPPH自由基能力也具有极显著的高度正相关性(P ＜0.01，r=0.807 8)，与清除ABTS自由基能力和铁还原能力没有显著的相关性(P ＞0.05，r=0.526 5、0.548 9)。

2.4 不同提取物对ABTS自由基的清除能力

高粱米不同溶剂提取物对ABTS自由基的清除能力的研究结果见表2。由表2可以看出，与DPPH试验结果不同，80%丙酮、80%甲醇和80%乙醇的提取物清除 ABTS自由基的能力较强(4.20～4.52 μmol Trolox/g)，这可能是由于三种提取液的多酚等有效成分构成对ABTS自由基有良好的选择性;其次清除ABTS自由基能力由高到低依次为蒸馏水＞甲醇＞乙醇＞丙酮＞正己烷＞乙酸乙酯，其中正己烷和乙酸乙酯提取物的清除能力分别为0.51μmol Trolox/g和0.49 μmol Trolox/g，远远低于其他溶剂提取物。杨红叶等［13］在研究苦荞提取液抗氧化性能的试验中也得到了相似的结果。

2.5 不同提取物的铁还原能力

高粱米不同溶剂提取物的铁还原能力测定结果见表2。由表2可以看出，80%丙酮提取物的铁还原能力最强(6.12μmol Fe(Ⅱ)/g)，还原能力强弱顺序依次为80%乙醇＞80%甲醇＞甲醇＞水＞乙醇＞乙酸乙酯＞丙酮＞正己烷，正己烷提取物的铁还原能力最弱，为2.21μmol Fe(Ⅱ)/g。从3个抗氧化试验结果来看，80%丙酮、80%甲醇和80%乙醇的提取物表现出较高的抗氧化能力，正己烷提取物的抗氧化能力最弱，而其他溶剂提取物由于试验体系的差异而表现出不同的抗氧化能力。这些不同提取物抗氧化能力的差异主要来自于不同溶剂导致的高粱提取物中抗氧化物质的量和种类所存在的差异。

表3 多酚、黄酮含量与各抗氧化活性的相关性

3 结论

试验结果表明，不同溶剂对高粱米提取物中的多酚、黄酮含量及其抗氧化活性有显著性的影响。80%丙酮提取物中的多酚、黄酮含量最高，分别为6.49 mg GA/g 和 61.2 mg/100 g，其表现出较好的抗氧化能力，清除 DPPH、ABTS自由基的能力分别为0.74、4.52 μmol Trolox/g，铁还 原 能 力 为 6.12 μmol Fe(Ⅱ)/g;其次80%甲醇和80%乙醇高粱提取物也具有较好的抗氧化能力，正己烷提取物中的多酚、黄酮含量较低，抗氧化能力较差。相关性分析表明，提取物中的多酚、黄酮含量与其抗氧化能力有较高的相关性，说明不同提取物抗氧化能力的差异主要来源于提取物中抗氧化物质的量的差异。因此，从试验结果上来看，80%丙酮是提取高粱米抗氧化物质的有效溶剂，但从安全和环保方面考虑，在实际应用中建议采用80%甲醇和80%乙醇提取高粱米抗氧化物质更为合适。

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