莪术油对人卵巢癌SKOV3细胞的影响及铂类耐药逆转作用

李艳芳， 李 敏， 刘首娟， 孔德胜， 李荣霞， 史淑红

(河北医科大学第二医院妇科，河北石家庄050000)

中西医结合防治肿瘤是我国治疗疾病的一大特色。近年来天然、低毒的中草药也受到了国际上的关注［1-2］，莪术油是中药莪术的主要提取物，近年来国内外通过现代药理学研究发现莪术油具有多种药理作用，因而备受关注。随着现代药理研究的深入和各种制剂［3-4］的开发，莪术油在抗病毒方面［5-6］、免疫调节［7］、抗肿瘤方面［8-9］研究日益增多。在妇科方面，众所周知的莪术油制剂保妇康栓广泛应用于临床，其疗效也得到临床的肯定。在科学研究中也有学者发现莪术油对宫颈癌细胞［8］、子宫内膜癌细胞［9］有明显的抑制作用，但是在在卵巢癌方面，尤其是在卵巢癌铂类耐药方面仍未见报道。

1 材料

人卵巢上皮癌细胞系SKOV3:由河北医科大学第四医院肿瘤研究所提供。人卵巢上皮癌顺铂耐药细胞系SKOV3/DDP:购买于中国科学院肿瘤研究所。莪术油注射液:徐州莱恩药业有限公司，规格:10 mL含莪术油0.1 g，国药准字H20067076。注射用顺铂 :齐鲁制药有限公司，规格:10 mg，国药准字H37021358。

2 方法

2.1 细胞培养 人卵巢上皮癌细胞株SKOV3及顺铂耐药细胞株SKOV3/DDP均于含10%胎牛血清(四季青无支原体优级胎牛血清，浙江天杭生物科技有限公司)的RPMI 1640培养液 (GIBCO上海英俊生物有限公司)进行培养，培养环境为37℃、5%CO2与相对饱和湿度。

2.2 MTT法测定莪术油对细胞增殖的抑制作用取对数生长期的SKOV3细胞，以每孔约9×103细胞接种于96孔培养板，每孔终体积为180μL加入不同质量浓度的莪术油注射液20μL，终质量浓度60、55、50、45、40、35、30 μg/mL，每个质量浓度设6个复孔，分别培养24 h、48 h后每孔避光加入20μL 5 mg/mL MTT溶液 (美国Sigma公司)继续培养4 h，小心吸弃孔内培养液，每孔加入150 mL DMSO(美国 Sigma公司)，轻微震荡10 min，待紫色结晶充分溶解，于490 nm波长处分别测定吸光度OD值。按下列公式求出生长抑制率(IR)。并计算半数抑制浓度 (IC50)。细胞生长抑制率 =(1－实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100%

2.3 流式细胞技术检测莪术油对细胞周期的影响

流式细胞技术检测莪术油对细胞周期的影响。对数生长期的SKOV3细胞，常规消化制备单细胞悬液，以每瓶1×106个细胞接种于新的细胞培养瓶中，待细胞生长同步后，吸去原培养液，加入含有莪术油的培养液4 mL，其中莪术油的浓度为其对SKOV3细胞的IC50，设空白对照组，于37℃，5%CO2培养箱中培养24 h和48 h终止培养，收集细胞，70%冰乙醇固定，核糖核酸酶A(RnaseA，美国Sigma公司)处理，碘化丙啶 (PI，美国Sigma公司)避光染色60 min，经200目尼龙网过滤后，流式细胞仪 (美国Beckmancouler-EPICSL)检测细胞周期。采用增殖指数来表示细胞增殖状态，即(S+G2)期的细胞数/总的细胞数。

2.4 莪术油对SKOV3/DDP细胞顺铂耐药的逆转作用

2.4.1 顺铂对人卵巢癌顺铂敏感细胞株的IC50取对数生长期的SKOV3细胞，以每孔约9×103细胞接种于96孔培养板，每孔终体积为180μL加入不同质量浓度的用含10%胎牛血清的完全培养液稀释的顺铂20μL，终质量浓度10、8、6、4、2、1μg/mL，每个质量浓度设6个复孔，培养48 h后每孔避光加入MTT溶液，继续培养4 h弃上清，加用DMSO，溶解紫色结晶，于490 nm波长测定吸光度OD值。计算生长抑制率 (IR)及IC50(具体同2.2项)。

2.4.2 2×2析因设计观察莪术油对SKOV3/DDP细胞株顺铂耐药性的影响。析因设计的两因素:敏感细胞株SKOV3的莪术油IC50;敏感细胞株SKOV3的顺铂IC50。两水平为有及无。实验具体分组如表1所示。

表1 析因设计分组Tab.1 Groups of experiment

2.5 数据处理 采用SPSS 17.0统计软件包进行处理，统计描述采用均数±标准差或中位数 (四分位间距)表示，采用曲线拟合计算半数抑制浓度，细胞周期率的比较采用卡方检验，析因设计采用析因设计的方差分析。

3 结果

3.1 莪术油对人卵巢癌SKOV3细胞的增殖抑制作用 倒置显微镜观察实验组的细胞，贴壁细胞较对照组减少，边缘毛糙，不规则，胞质颗粒感增强。随着莪术油质量浓度的增加，变化越明显。48 h组较24 h组更明显。

MTT比色结果显示，莪术油注射液对人卵巢上皮癌细胞的增殖具有明显的抑制作用，抑制率呈浓度和时间依赖性。抑制率随着莪术油质量浓度的增高而增加，作用时间48 h较24 h对细胞的抑制程度大。据莪术油质量浓度对48 h抑制率作图，符合二次回归变化规律，R2=0.995，F=428.860，P＜0.01，曲线方程为 Y^=－2.443+0.121X－0.001X2计算莪术油对人卵巢癌SKOV3细胞的半数抑制浓度IC50为33.71μg/mL。

3.2 莪术油对卵巢癌SKOV3细胞周期的影响 实验结果显示无论是莪术油作用24 h，还是48 h，周期中各个时相的构成较对照组均有明显的变化。24 h组对照组G1期细胞比例为32.7%，而实验组经莪术油作用后增加至47.9%，相反S期细胞对照组51.8%降至32.5%，差别有统计学意义 (x2=367.002，P＜0.01)。48 h组变化趋势于24 h组一致，即莪术油可以使SKOV3细胞G1期比例增加，而下调S期细胞比例，即莪术油可以将人卵巢癌SKOV3细胞阻滞于G0/G1期。但是24 h组和48 h组差别无显著性。

增殖指数即S+G2期细胞的百分比，24 h组及48 h组均与对照组有明显差别 (如表2)，此结果也说明了莪术油对SKOV3细胞的增殖有显著的抑制作用。

表2 莪术油对SKOV3细胞增殖指数的影响Tab.2 Comparison of prdiferation index between G1 phase and(S+G2)phase in SKOV3 cell

3.3 莪术油对SKOV3/DDP细胞顺铂耐药的逆转作用

3.3.1 顺铂对SKOV3/DDP细胞的IC50MTT比色法测得顺铂对SKOV3细胞系增殖抑制率随顺铂质量浓度的增加而增加，根据双变量相关性分析，顺铂对SKOV3细胞的抑制作用呈现对数函数关系(R2=0.961，F=99.672，P ＜0.01，Y^=13.169+34.921ln X)。计算 IC50为2.87μg/mL。

3.3.2 莪术油对SKOV3/DDP细胞株顺铂耐药性的影响 各试验组对SKOV3细胞的抑制率如表3所示，A组为66.01%，B组为3.74%，C组为49.75%，D组为0，差别具有显著性，即A、B、C、D各组细胞的增殖状态不全相同，(F=47.054，P＜0.01)。

表3 四组之间抑制率的比较Tab.3 Comprison of inhibition rate among four groups

析因设计的方差分析结果显示，莪术油的主效应 (F=422.410，P＜0.01)、顺铂的主效应(F=13.470，P＜0.01)及二者的交互效应 (F=5.283，P＜0.05)，即莪术油、顺铂均可抑制SKOV3细胞的增殖，二者合用对细胞生长的抑制有协同作用，莪术油可以增加耐药细胞对顺铂的敏感性，交互作用图见图1所示，二者呈相交直线关系。

图1 莪术油、顺铂交互作用图Fig.1 Interactions plot of zedoary oil and cisplatin

4 讨论

4.1 对人卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用 中西医结合防治肿瘤是我国的特色之一，高效、低毒的天然中草药越来越受到国内外学者的青睐。莪术为姜科植物温郁金Curcuma wenyujin Y．H．Chen et C．Ling的干燥根茎，性温，味苦、辛，有破血祛瘀、行气止痛之功效［10］。莪术油为莪术的非极性溶剂提取物所含的挥发油，其成分复杂，主要含有多种低沸点的倍半萜和单萜化合物［11］。近年国内外通过药理学研究发现它是安全性很高的药物，且具有药理活性强、高效性等特点［12］，具有广谱的抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗凝血和抗氧化的活性［13］，其中抗肿瘤是莪术油最主要的药理作用，对各细胞周期都有抑制作用［14-15］。这一点已经在肝癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌、鼻咽癌中得到证实。

本实验结果表明莪术油对卵巢癌细胞的体外增殖有明显的抑制作用，其抑制作用呈质量浓度依赖性，这一结论与杨美春等［16］报道一致。从实验结果可以看出，莪术油对人卵巢癌SKOV3细胞的抑制作用随莪术油质量浓度的增加呈陡增性，莪术油质量浓度为30μg/mL时其抑制率为20%左右，但是质量浓度为40μg/mL其抑制率接近70%。经计算得出莪术油对卵巢癌SKOV3细胞的半数抑制质量浓度34μg/mL。

4.2 流式细胞技术检测莪术油对人SKOV3细胞周期的影响 细胞周期一般分为G0、G1、S、G2、M时期，DNA的量也随各时相呈现出周期性的变化。流式细胞技术分析细胞周期是依据细胞DNA量来分析的。抗肿瘤药物常通过抑制肿瘤细胞DNA的合成而发挥其抗肿瘤作用，它可以影响DNA合成过程的任何阶段，受损的DNA常被阻滞在G1期而不进入S期复制;或者被阻滞在G2期，从而阻断其进入M期进行异常的有丝分裂［17］，长期的临床实践及实验研究中，人们已经发现抗肿瘤药物与中药联合应用提高临床疗效，但对其机制的了解还不够深入［18-20］。

本研究结果显示经莪术油作用后，SKOV3细胞周期中各个时相的细胞所占的比例较对照组有明显的变化，表现为G1期细胞比例均较对照组明显增加，相应的S期、G2期细胞比例明显减少，差异有统计学意义，细胞周期呈明显G1期阻滞状态，也就是说莪术油可以将人卵巢上皮性恶性肿瘤SKOV3细胞阻滞在G0/G1期，从而阻断细胞周期，抑制细胞的增殖。增殖指数即S+G2期细胞的百分比，实验结果显示莪术油组明显低于对照组(P＜0.01)，莪术油组的SKOV3细胞的增殖能力显著低于对照组，进一步证实了莪术油对人卵巢上皮性恶性肿瘤SKOV3细胞的增殖有显著的抑制作用。

本实验莪术油对SKOV3细胞周期的影响，在其作用24 h和48 h后差别不大，而本实验中为了满足流式细胞仪检测样本需要的细胞数，细胞培养的时候接种的细胞数量比较多，不排除在第二个24 h时，细胞数量已经很多，细胞营养相对不足，增殖能力下降的可能，从而不符合一般的生长曲线。这一现象有待进一步证明。

4.3 SKOV3/DDP细胞株顺铂耐药性的影响 肿瘤细胞多药耐药性的产生是卵巢癌复发、未控、转移的主要原因，其产生机制相当复杂，多年来的研究也未能完全阐明。细胞耐药性的产生往往是多种机制共同参与，但是多年来对于多药耐药性的研究始终没有找到满意的药物可以逆转化疗药物的耐药性。第一代MDR逆转剂如钙调节剂维拉帕米，可以通过竞争P-gp的结合位点从而增加药物的敏感性，但是在体内必须需要足够的浓度才可以逆转耐药，这个浓度已经超过了维拉帕米在体内产生毒性的最小剂量，从而限制了其使用。第二代MDR逆转剂由于干扰抗肿瘤药物的药代动力学也限制了使用［21］。由于耐药机制的复杂性和多元性，化学药物只能针对其中一种耐药机制进行逆转，而祖国的传统中药本身成分复杂，其治疗肿瘤的特点也就具有多靶点、多层次、综合调节的特点，目前越来越多的学者目光转向中草药，并且已有研究表明许多中医药对耐药细胞的凋亡有诱导作用，在中药中筛选低毒、高效的耐药逆转剂将成为肿瘤MDR逆转剂研究的一个新的方向［22-23］。李娟［24］的研究中也证实大黄素通过降低MDR-1、XIAP和Survivin的表达从而增加卵巢癌细胞对紫杉醇的药物敏感性，促进细胞凋亡。本研究采用2×2析因设计的实验分组，分析了莪术油和顺铂联合应用之间的交互作用，结果表明二者合用对人卵巢癌顺铂耐药细胞SKOV3/DDP的抑制作用存在交互作用，顺铂与莪术油合用可以增加二者对SKOV3/DDP细胞的抑制作用，由此可以认为，莪术油可以增加细胞对顺铂的敏感性，换言之，莪术油在一定程度上可以改善人卵巢癌SKOV3/DDP细胞株的顺铂抗药性。但是关于莪术油在逆转耐药方面的作用机制，还有待进一步研究。

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