肿瘤坏死因子基因多态性与男性青少年品行障碍的关联☆

刘丽禹顺英邵阳张燃谢斌

大量研究表明，遗传因素在品行障碍（Conduct Disorder，CD）的发生发展中起到重要作用[1-2]，而且遗传导致的神经发育异常可能与CD的核心症状如冲动、暴力攻击等密切相关。2011年Dick等[3]对CD者症状的全基因组关联分析发现，肿瘤坏死因子相关蛋白7（C1QTNF7）基因中的rs16891867、rs7950811、rs11838918、rs1861046 和rs4698107与 CD 症状相关（P<5×10-8）。目前C1QTNF7的作用机制并不明确，可能与血浆中肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF）水平有关[3]。既往研究显示TNF水平与生活事件应激反应、HPA轴调节及防御方式有关[4-6]，而应激不仅与CD的形成有关，而且应激所致的HPA轴功能改变也与青少年暴力等行为问题存在密切联系。但目前国内外尚缺乏此基因与CD的关联研究，故本研究对中国汉族男性青少年CD患者中C1QTNF7基因多态性是否与CD的发生相关进行探讨。此外，大量研究表明，CD与注意缺陷多动障碍（Attention Deficit Hyperactivity Disorder，ADHD）共病率较高，可能存在共同的遗传基础[7]，因此本研究又根据患者是否共病ADHD分组，进一步探讨其共病机制。

1 对象与方法

1.1 研究对象 来自因犯罪而新入上海未成年人管理教养所（以下简称少管所）的男性青少年，案件性质包括抢劫、伤害、扰乱治安、盗窃和诈骗等。符合《美国精神障碍分类与诊断统计手册第四版》（The Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，DSM-IV）CD的诊断标准；排除严重的心脏疾病、肝、肾功能损害及血液疾病者、严重消化系统疾病者、严重营养不良者，以及合并有明显神经、精神疾病史者。符合标准的对象在取得本人以及法定监护人的知情同意之后正式入组。由两名主治以上医师对CD患者明确诊断，并由专职研究员使用国际神经精神科简式访谈问卷（mini-mental state examination，MINI）5.0.0中文版复核诊断。共72例CD患者符合以上标准并最终入组，年龄16～18岁，平均（17.07±0.85）岁。根据DSM-IV中ADHD的诊断标准将CD组又再分为ADHD组（22例）和非ADHD组（50例），平均年龄分别为17.12岁和17.05岁，两组年龄比较无统计学差异（t=0.484,P=0.63）。

对照组来自本市某区健康体检站体检人群。国内外研究发现CD的高峰年龄一般认为是15～18岁[8]，18岁之后性格特质稳定，CD行为发生率显著减少或消失。故对照组纳入标准设为年龄18岁以上，并且18岁之前无CD无ADHD行为的汉族男性健康体检者。体检时由专职研究员使用MINI问卷5.0.0中文版进行筛查。排除标准同病例组。共收集178名对照，年龄18～60岁，平均（24.24±7.34）岁，与CD组的年龄存在统计学差异（t=12.77，P<0.05）。

所有研究对象对本研究知情同意并签署知情同意书。本研究获得上海交通大学医学院附属精神卫生中心伦理委员会审核批准。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取 因在少管所内采集静脉血存在一定困难，故CD组采用口腔黏膜拭子采集黏膜细胞，用特异性结合DNA的离心吸附柱试剂盒（美国ABI公司订制）提取DNA，冻存于－80℃冰箱待测。对照组采集静脉血5mL，EDTA抗凝，用酚氯仿法在当天或次日提取DNA，冻存于－80℃冰箱待测。

1.2.2 基因多态性检测 本研究根据全基因组关联研究（Genome Wide Association Studies，GWAS）阳性结果，以及HapMap数据库中中国北京汉族（Chinese Han origin in Beijing，CHB）数据，根据最小等位基因频率（Minor Allele Frequency，MAF）＞10%，连锁不平衡系数（R2）＞0.8，进行筛选，最终选择rs4698107和rs16891867两个位点进行检测。

使用SnaPshot法进行基因分型，rs4698107PCR引物 F-CAGGGCTCCCACTGATTCTA，R-CGCAGATGCACTTGTGTCTT，合成片段589bp，延伸引物为ATTGTCTTCCATGAAACCAGTCCCTGGTGCCAAAACGTTC。rs16891867 PCR引物F-CCACAACCCAGTTAAAAGAGG，R-TTAAAACAGTGTCTTTGGAGTCAA，合成片段381bp，延伸引物为AATGACACCGAAAAAACAGCAGAAAATTGTAAGACCTACTCTGTGCTGAGAAAAT。PCR扩增反应体系为15µL，DNA（原液）2µL，dNTP Mixture（2.5mM）0.5µL，10 × PCR Buffer（Takara）1.5µL，Taq HS（Takara）（5U/µL）0.15µL，引 物（0.2µL+0.2µL）（10pmol/µL），以灭菌水补足到15µL。PCR反应程序：95℃ 2min（95℃ 40s＋60℃30s＋72℃ 1min 30s）×35cycle 72℃ 8min。将 PCR产物取5µL进行2.5%琼脂糖电泳检测。PCR产物纯化：10µL SAP 酶（Takara）（1U/µL）1µl，ExonI酶（Takara）（5U/µL）1µL，反应温度为 37℃ 80min和85℃15min。延伸反应反应体系15µL；反应温度96℃ 1min（96℃ 10s＋50℃ 5s＋60℃ 30s）×28cycle。纯化：PCR 产物 10µL，SAP酶（Takara）（1U/µL）1µL，反应温度：37℃ 80min，75℃ 15min。ABI 3130XL测序仪测序，原始数据分析采用Gene-Mapper 4.1。

1.3 统计学方法 应用SPSS 13.0和SHEsis在线软件（http://analysis2.bio-x.cn/myAnalysis.php）进行数据的统计分析。采用χ2检验分析单位点基因型分布是否符合Hardy-weinberg平衡法则，χ2检验用于比较各位点基因型、等位基因频率在病例组和对照组间的分布差异。运用SHEsis在线软件构建单倍体进行单体型分析，单体型是指位于一条染色体特定区域的一组相互关联并倾向于以整体遗传给后代的单核苷酸多态的组合，单体型分析是根据实际数据推断预测的结果，结果使用期望值表示。检验水准α为0.05，双侧检验。将CD组被试根据是否存在ADHD分亚组，用χ2检验比较三组各位点的基因型和等位基因频率，两两比较采用Bonferroni法调整检验水准，调整后α为0.017。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg平衡检验 经χ2检验单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）rs4698107和rs16891867在CD组（χ2分别为0.44和0.92）以及对照组（χ2分别为0.06和0.08）均符合Hardy-weinberg平衡定律（均P>0.05），CD组和对照组具有群体代表性。

2.2 CD组与对照组C1QTNF7基因两位点多态性分析 CD组中rs4698107位点A等位基因频率高于对照组（χ2=5.027，P=0.025），OR 值为 1.72，95%CI为（1.07，2.76），基因型分布在两组中存在统计学差异（χ2=8.051，P=0.018）。rs16891867的等位基因频率（χ2=0.625，P>0.05）和基因型（χ2=1.123，P>0.05）分布在两组中无统计学差异。见表1。两组两位点单体型分布无统计学差异（χ2=3.690，P>0.05）。见表2。

表1 CD组与对照组C1QTNF7两位点基因频率、基因型的比较（n，%）1)

表2 CD组与对照组单体型rs4698107-rs16891867的比较1)

2.3 ADHD组、非ADHD组及对照组两位点多态性分析 将CD组被试根据是否存在ADHD分亚组，比较三组各位点的基因型和等位基因频率。三组中rs4698107等位基因分布无统计学差异（χ2=5.637，P>0.05）；基因型分布存在统计学差异（χ2=12.842，P=0.012），进一步两两比较，ADHD组与对照组间基因型分布存在统计学差异（χ2=11.544，P=0.003）。rs16891867位点等位基因频率和基因型在三组中的分布均无统计学差异（P>0.05）。见表3。

表3 两个SNP基因频率与基因型的比较（n，%）1)

3 讨论

品行障碍（CD）是临床上常见的一类破坏性行为障碍，有关的病因学研究提示CD具有遗传基础，遗传度达40%～50%[1]。目前对CD候选基因的研究主要包括单胺氧化酶A（monoamine oxidase A，MAOA）、5-羟色胺转运体（serotonin transporter,5-HTT）、儿茶酚胺甲氧基转移酶（catechol-O-methyltransferase，COMT）和脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）等[9]，但研究结果并不一致，因此有必要对CD可能的遗传位点继续探讨。

C1QTNF7基因位于4号染色体短臂15.3区。GWAS研究发现，C1QTNF7中5个SNP与CD症状相关（P<5×10-8），此基因多个SNP与CD有显著相关性，而且多位点间完全连锁不平衡程度不高[3]。因此有理由相信C1QTNF7基因多态性与CD症状存在相关性，但国内外未有研究报道证实。C1QTNF7影响CD的机制仍然不明确，可能与血浆中TNF水平有关。众多研究表明，TNF水平的增高与敌意、愤怒和攻击情绪密切相关[10-11]，而攻击行为是CD的主要症状之一，因此肿瘤坏死因子相关基因可能会影响CD疾病的发生。本研究对男性青少年CD患者的C1QTNF7基因中rs16891867、rs4698107两位点SNPs进行研究发现，CD组中rs4698107位点A等位基因频率高于对照组，基因型分布在两组间也存在统计学意义。rs16891867的等位基因频率和基因型在两组比较中无差异，与之前GWAS研究不一致。可能的原因是，Dick等[3]的GWAS研究选取的人群是物质依赖的患者，虽然物质依赖与CD共病率较高，但其症状表现毕竟只有交叉而无必然的重叠，因此不一定存在完全相同的患病基因。同时，CD发生的具体机制不明确，环境、心理社会因素也起到重要作用，而且本研究对象都是青少年男性CD患者，而且样本量较小，因此可能会有一定的偏倚结果产生。

当对CD组按是否共患多动障碍（ADHD）分组时，结果发现，rs4698107位点基因型在三组比较中存在统计学差异，进一步分析发现伴有ADHD的CD患者基因型与对照组比较存在统计学意义，而不伴有ADHD的CD患者与对照组之间没有发现差异。临床资料显示10岁以前的儿童中，ADHD和CD共患病率高达54%[12]，两种疾病间可能存在共同的遗传机制，含有rs4698107 A等位基因的青少年可能更容易共病，而在不伴有ADHD的CD患者中没有发现差异，可能与分亚型后各组样本量减少，导致检验效能下降而出现假阴性有关。

本研究也存在一定的局限性。首先，因样本收集有一定的难度，样本量较小，结果的可靠性还需大样本研究的验证。而且本研究对象来自因犯罪而新入少管所的男性青少年，样本有一定局限性，未考虑疾病严重程度、犯罪性质及人格特质等[13]，所以本研究结果可为将来的研究提供一个新的研究方向。其次，对于ADHD的诊断访谈是基于研究对象本人，未访谈患儿家长，因此ADHD有可能漏诊。综上所述，本研究仅为初步结果，具有一定的参考价值，今后有待于更多临床试验的进一步研究。

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