配对盒4基因Arg121Trg多态性与2型糖尿病的相关性

邓德耀，袁文丽*，杨双娟，冯 倩，高宗鹰，方 芳，李显丽

(1.云南省第二人民医院检验科，云南昆明650021;2.中国科学院昆明动物研究所遗传资源与进化国家重点实验室，云南昆明650223;3.云南省第二人民医院内分泌科，云南昆明650021)

胰岛特异性转录因子-配对盒4(paired box4，Pax4)基因属于编码促进胚胎组织细胞增殖、分化及存活的转录因子家族。Pax4基因表达对于维持胰岛细胞表型及胰岛β细胞的增殖和分化具有至关重要的作用［1－2］，它的基因多态性可能与糖尿病的发生相关［3－9］。本研究应用高分辨率熔解曲线(high resolution melting，HRM)方法，对云南省昆明地区430例2型糖尿患者群Pax4基因Arg121Trg多态性(rs114202595)进行分析，旨在探讨Pax4基因Arg121Trg多态性与2型糖尿患者群的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象

本研究选择了云南省昆明地区具有医疗记录的430例2型糖尿病患者(T2DM)、200例糖耐量减低人群(IGT)和446例性别和年龄相匹配的OGTT正常的体检人群(NGT)，并获得了受试者的知情同意。糖尿病及糖耐量减低诊断采用WHO1999年诊断标准。

1.2 试剂

即用PCR扩增试剂盒(上海生工生物工程有限公司)，LightCycler 480高分辨率熔解扩增试剂盒(德国罗氏诊断有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 临床资料收集:所有研究对象采用统一调查表进行调查，内容包括一般情况、个人史、家族史以及药物使用情况等。研究对象行OGTT试验后在日立7600全自动生化分析仪上测定血糖。胰岛素和C肽均用放射免疫法检测。稳态模型胰岛素抵抗指数HOMA-IR=FPG×FINS/22.5，稳态模型胰岛素分泌指数HOMA-β=20×FINS/(FPG－3.5)。

1.3.2 基因组DNA制备:酚-氯仿-异戊醇法提取基因组DNA，紫外分光光度计对DNA浓度进行测定，将所有DNA样品稀释至20 ng/μL。

1.3.3 引物的合成:根据Primer 3.0软件设计Pax4基因的引物。上游引物序列:5'-GTAGGTGGAGAC AGATGGGAAA-3';下游引物序列:5'-GTAGTCCCTG GTCCTCCTGTAA-3'。引物由上海生工生物工程有限公司合成，用HPLC纯化。

1.3.4 HRM检测:Pax4基因 Arg121Trg多态性PCR体系:10 ng的基因组DNA、1×PCR Master mix、2.0 mmol/L MgCl2、200 nmoL的正反向引物，并用PCR级别的水补足至20 μL。PCR条件:95℃预变性10 min后行触底PCR，即95℃ 10 s，65℃ ～55℃退火15 s，72℃ 10 s，55个循环，其中前10个循环65℃ ～55℃，每个循环退火温度降1度，后45个循环退火温度维持55℃。HRM分析条件:95℃1 min，40℃ 1 min，熔解曲线数据收集从65℃到95℃，温度上升率为1℃/s，且每升高1℃进行15次数据采集。最后40℃冷却10 s。应用gene scanning软件进行实时数据检测和分析。随机选取不同熔解曲线的产物共20例测序验证基因型结果。以测序得到的野生纯合子GG(Arg/Arg)、突变杂合子GA(Arg/Trg)和突变纯合子AA(Trg/Trg)分别作为标准品，分析其他DNA样本基因型。

1.4 统计学分析

2 结果

3组间年龄、性别构成比无差异。与NGT组相比，IGT及 T2DM组的 FBG、PBG均有升高 (P＜0.01)。IGT和T2DM组的FINS和C0min均显著高于NGT组(P＜0.05);IGT组PINS和C120min均显著高于NGT组(P＜0.01)和T2DM组(P＜0.05)。IGT、T2DM组的HOMA-IR均显著高于NGT组(P＜0.01)，而T2DM组的HOMA-β则显著低于NGT组(P＜0.01)和IGT组(P＜0.05);从 NGT到 IGT到T2DM过程中，HOMA-IR逐渐增加(表1)。

Pax4基因Arg121Trg单核苷酸多态性位点基因型(图1)明显的分为 GG(Arg/Arg，蓝色曲线)、GA(Arg/Trg，红色曲线)、AA(Trg/Trg绿色曲线)3型，且与测序结果一致(图2)。

GG纯合子(Arg/Arg)在T2DM组中的频率0.909，在IGR组中为0.935，在NGT组为0.939;A等位基因(Trp121)和G等位基因(Arg121)的频率在3组间分布如表2所示。T2DM组Arg121Trg单核苷酸多态性GA+AA基因型(Arg/Trg+Trg/Trg)人群的胰岛素使用率为69.2%，显著高于GG基因型(Arg/Arg)人群(P=0.001)。而GG基因型和GA+AA基因型的表型间的其他指标 FBG、FINS、C0min、PBG、PINS、C120min、HOMA-IR和HOMA-β见表3所示。

表1 NGT、IGT和T2DM组个体临床变量比较Table 1 The clinical data in normal group，glucose tolerance group and diabetes group

图1 Pax4基因Arg121Trg多态性3种不同基因型的高分辨率熔接曲线图Fig 1 Genotyping of Arg121Trg polymorphism of Pax4 by high resolution melting

图2 Pax4基因Arg121Trg多态性3种不同基因型的测序图Fig 2 Genotyping of Arg121Trg polymorphism of Pax4 by sequencing

表2 T2DM组、IGT组和NGT组Pax4基因Arg121Trg基因型与等位基因分布频率Table 2 The distribution frequencies of genotype and allele of Arg121Trg among type 2 diabetes group，impaired glucose tolerance group and normal group

表3 T2DM组Pax4基因Arg121Trg基因多态性与临床变量Table 3 The polymorphism of Arg121Trg of Pax4 gene and clinical data in type 2 diabetes group

3 讨论

在本研究中，云南省昆明地区430位T2DM患者Pax4基因rs114202595位点GG基因型及A等位基因频率与日本人［7］、印度北部［8］及中国湖南省人群［9］的文献报道不尽一致，且3组间未见显著性差异。这些不同国家和地区Trg121分布频率的差异很可能源于遗传异质性、群体差异或者是基因和环境的相互作用。本研究中T2DM组患者FBG平均水平在8.015左右，但FINS和C0min水平较IGT组未见明显升高，同时PINS和C120min均显著低于IGT组。说明本研究中T2DM人群存在一定程度的胰岛β细胞分泌功能的早期损害。值得注意的是，本研究中T2DM组GA+AA基因型人群的胰岛素使用率比GG基因型显著增加，此结果与日本793例2型糖尿病患者不同基因型研究中胰岛素使用情况一致［7］。结合起来分析，Pax4基因 Arg121Trg位点 A等位基因可能是2型糖尿患者群胰岛β功能进展性紊乱的一个分子标记。也就是说，含有A等位基因的T2DM人群存在严重的胰岛素缺乏，他们需要更早接受胰岛素治疗来代替口服降糖药物治疗。当然，本研究样本量较小，尚需进一步的大样本量前瞻性研究加以证明。

本研究还发现T2DM组Pax4基因Arg121Trg多态性两种基因型间的临床变量除胰岛素使用率外，其他指标均无明显差异，而在日本人的研究中观察到Trp121携带者第一相C-肽分泌水平显著高于对照人群［7］，以湖南省人群为受试对象的研究发现R等位基因携带者餐后胰岛素水平显著高于W等位基因携带者［9］，但在本研究中并未观察到上述差异。此结果提示，除Pax4基因Arg121Trg多态性外，还可能存在其他的未证实因素共同影响胰岛β细胞的分泌功能。Pax4基因Arg121Trg多态性A等位基因(Trp121)，作为2型糖尿患者群胰岛β功能进展性紊乱的分子标记之一，也许并未对其可能出现的胰岛素分泌能力紊乱做出重要的贡献，而仅是其发生的因素之一。

本研究只是在应用HRM方法的基础上对较小样本T2DM人群Pax4基因Arg121Trg位点进行了多态性分析，并推测A等位基因(Trp121)可能是2型糖尿患者群胰岛β功能进展性紊乱的一个分子标记，含有A等位基因(Trp121)的2型糖尿患者群需要更早接受胰岛素治疗来代替口服降糖药物治疗。当然，精确的评估尚需通过大规模临床试验和流行病学研究予以证实。

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