胡桃醌通过降低AKT活性抑制肺癌A549细胞增殖

刘元银，雷淑慧，杨 燕，蒋幼凡*

(1.重庆医科大学附属第二医院呼吸内科，重庆400010;2.铜梁县人民医院重症监护科，重庆402560;3.攀枝花市中心医院呼吸内科，四川攀枝花617067)

肽酰脯氨酰顺反异构酶(peptidyl-prolyl cis/trans isomerase，PIN1)是目前已知调节磷酸化丝氨酸/苏氨酸基序顺反构象变化唯一的酶［1］，在多种肿瘤组织中都呈现过表达［2］。胡桃醌是PIN1的天然抑制剂。有研究发现胡桃醌可以促进肺癌细胞的凋亡，同时可以减少裸鼠皮下肺癌移植瘤的形成［3］，但有关胡桃醌抑制肺癌的分子机制研究甚少。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 B(serine/threonine protein kinase B)PKB，即AKT是肿瘤增殖信号通路中的一个重要节点［4］。本实验将探讨PIN1抑制剂胡桃醌对AKT的影响及其在肺癌A549细胞增殖中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

人肺腺癌A549细胞(重庆医科大学基础研究室);胡桃醌(Juglone，Sigma公司)，纯度98%;RNA提取试剂盒(百泰克公司);RNA反转录试剂盒、real-time PCR试剂盒(TaKaRa公司);PIN1、AKT及AKT-pS473兔单克隆抗体(Epitomics公司);MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(碧云天公司);Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒(贝博公司)。

1.2 方法

1.2.1 药物配制:用二甲基亚砜(DMSO)将胡桃醌配制成终浓度为2 mmol/L的工作液，DMSO终浓度控制在0.1%以下，4℃避光下保存，使用时用不含血清的新鲜1640培养液倍比稀释成所需浓度。

1.2.2 细胞培养:用含10%胎牛血清的新鲜1640培养液培养A549细胞，隔天换液1次，每3～5天传代1次。

1.2.3 MTT法检测细胞增殖:取对数生长期A549细胞，按1×107个/L的浓度分别接种到96孔培养板上，分别加入含有终浓度为 0、6.25、12.5、25 和50 μmol/L胡桃醌，同时设无细胞空白对照，培养24和48 h，每个浓度设3个复孔，重复3遍，按MTT试剂盒步骤进行检测，并按照下面公式计算不同浓度胡桃醌对A549细胞增殖的抑制:细胞抑制率(%)=(1－实验组平均A值/正常对照组平均A值)×100%。

1.2.4 流式细胞术检测A549细胞凋亡率:将A549细胞以5×104个/孔接种于6孔板，培养12 h后加入不同浓度胡桃醌，48 h后收集细胞，按 Annexin V-FITC/PI试剂盒步骤操作，上流式细胞仪检测。

1.2.5 流式细胞术检测A549细胞周期:按参考文献［5］方法进行。

1.2.6 Real-time PCR法检测PIN1及AKT的mRNA表达:按参考文献［2］方法进行，PCR引物如下:PIN1上游;5'-AGGACTTTGAGTCTCTGGCCTCAC-3';下游5'-AGGCGTCTTCAAATGGCTTCTG-3';AKT上游5'-CTTTCCAGACCCACGACC-3';下游5'-CTCCG AGTGCAGGTAGTCC-3';GAPDH上游5'-TGATTCTA CCCACGGCAAGTT-3';下游 5'-TGATGGGTTTCCCA TTGATGA-3'。

1.2.7 Western blot法检测PIN1、AKT及AKT-pS473蛋白的表达:按参考文献［6］方法进行。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 胡桃醌对A549细胞增殖的影响

经不同浓度的胡桃醌处理24和48 h后，细胞增殖均被显著抑制。胡桃醌处理组间均有显著差异(P＜0.05)，抑制作用呈浓度依赖性增加(r=0.927)(表1)。

2.2 胡桃醌对A549细胞凋亡的影响

不同浓度胡桃醌组A549细胞凋亡较对照组显著升高(P＜0.05)，并以晚期凋亡细胞或坏死细胞为主。高浓度处理组较低浓度处理组凋亡率更高，不同浓度胡桃醌处理组间均有差异(P＜0.05)(图1，表2)。

2.3 胡桃醌对A549细胞周期的影响

胡桃醌能浓度依赖的降低A549细胞的G0/G1期细胞的比例，升高G2/M期和S期细胞比例，造成A549细胞在G2/M期和S期的阻滞(表2)。

2.4 胡桃醌对PIN1、AKT mRNA的表达影响

各胡桃醌处理组PIN1 mRNA的表达较对照组显著降低(P＜0.05)。其高浓度处理组较低浓度处理组表达更低，不同浓度胡桃醌处理组间均有差异(P＜0.05)(表3)。25 μmol/L胡桃醌处理细胞48 h比24 h的PIN1 mRNA表达更低(P＜0.05)(表4)。

2.5 胡桃醌对A549细胞PIN1、AKT、AKT-pS473蛋白表达的影响

不同浓度胡桃醌组中PIN1、AKT-pS473的蛋白表达较对照显著降低(P＜0.05)，其高浓度处理组较低浓度处理组表达更低，不同浓度胡桃醌组间均有差异(P ＜0.05)(图 2，表3)。25 μmol/L胡桃醌处理48 h细胞中 PIN1、AKT-pS473的蛋白表达较24 h时更低(P ＜0.05)(图3，表4)。

表1 MTT法检测细胞的生长抑制情况Table 1 The inhibitory rate against cells growth measured by MTT assay(±s，A Value，n=4)

表1 MTT法检测细胞的生长抑制情况Table 1 The inhibitory rate against cells growth measured by MTT assay(±s，A Value，n=4)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 compared with control group;#P ＜0.05 compared with lower juglone concentration group．

group 24 hours IR 48 hours IR 63.67%control 0.625±0.052 － 0.960±0.069 －6.25 μmol/L Juglone 0.587 ±0.034* 6.34% 0.882 ±0.057* 8.09%12.5 μmol/L Juglone 0.492 ±0.016*# 21.24% 0.699 ±0.045*# 27.14%25 μmol/L Juglone 0.341 ±0.008*# 45.40% 0.423 ±0.024*# 55.9%50 μmol/L Juglone 0.274 ±0.005＊＊# 56.14% 0.335±0.015＊＊#

图1 流式细胞术检测A549细胞凋亡Fig 1 The apoptosis rate of A549 cells detected by flow cytometry

表2 流式细胞仪检测A549细胞凋亡率及细胞周期变化Table 2 The cell apoptosis rate and cell cycle of A549 detected by Flow cytometry(±s，%，n=3)

表2 流式细胞仪检测A549细胞凋亡率及细胞周期变化Table 2 The cell apoptosis rate and cell cycle of A549 detected by Flow cytometry(±s，%，n=3)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 compared with control group;#P ＜0.05 compared with lower juglone concentration group．

/M control 4.20±0.20 71.35±5.37 18.78±1.14 9.8 group apoptosis rate G0/G1 S G2 54.23±2.21 27.88±1.23 17.89±1.54 7±0.96 6.25 μmol/L Juglone 8.70±0.40* 65.23±4.56 23.54±1.47 11.23±1.05 12.5 μmol/L Juglone 27.40±1.20*# 57.89±3.04 26.13±1.12 15.98±1.24 25 μmol/L Juglone 56.40±3.80*# 55.48±3.45 27.09±1.83 17.43±1.25 50 μmol/L Juglone 65.50 ±4.60＊＊#

表3 不同浓度胡桃醌处理组A549细胞中mRNA和蛋白的相对表达Table 3 Relative mRNA and protein expression in A549 cells treated by different concentration of Juglone(±s，n=5)

表3 不同浓度胡桃醌处理组A549细胞中mRNA和蛋白的相对表达Table 3 Relative mRNA and protein expression in A549 cells treated by different concentration of Juglone(±s，n=5)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 compared with control group;#P ＜0.05 compared with lower juglone concentration group．

046 0.516±0.011 0.626±0.015 6.25 μmol/L Juglone 0.807±0.050* 0.995±0.061 1.032±0.056* 0.522±0.019 0.554±0.023*12.5 μmol/L Juglone 0.708±0.067*# 1.003±0.080 0.892±0.024*# 0.522±0.020 0.464±0.018*#25 μmol/L Juglone 0.521±0.040*# 0.998±0.072 0.596±0.023*# 0.516±0.015 0.362±0.015*#50 μmol/L Juglone 0.282±0.020＊＊# 0.999±0.050 0.396±0.021＊＊# 0.514±0.018 0.228±0.020＊＊#mRNA PIN1 AKT AKT-pS473 control 1.002±0.01 1.000±0.009 1.280±0.group PIN1 mRNA AKT

表4 不同时间胡桃醌(25 μmol/L)处理组A549细胞中mRNA和蛋白的相对表达Table 4 Relative mRNA and protein expression in A549 cells treated by Juglone for different time(±s，n=5)

表4 不同时间胡桃醌(25 μmol/L)处理组A549细胞中mRNA和蛋白的相对表达Table 4 Relative mRNA and protein expression in A549 cells treated by Juglone for different time(±s，n=5)

＊P ＜0.05 compared with the group treated by 25 μmol/L juglone for 24 hours．

mRNA PIN1 AKT AKT-pS473 24 hours 0.712±0.057 0.999±0.080 0.764±0.03 group PIN1 mRNA AKT 2 0.512±0.031 0.436±0.023 48 hours 0.521±0.042* 0.998±0.071 0.575±0.036* 0.514±0.023 0.338±0.014*

3 讨论

胡桃醌是PIN1的天然抑制剂，它对肺癌、乳腺癌、肝癌、大肠癌等多种肿瘤细胞均表现出较好的抗癌活性。胡桃醌对肺癌细胞具有明显的生长抑制作用，阻止细胞周期进程，诱导肺癌细胞凋亡，在体内外实验研究中均表现出抗癌活性［7－8］。本实验也发现胡桃醌可剂量依赖性的抑制A549细胞增殖，促进细胞凋亡，将细胞周期阻滞在G2/M和S期，从而发挥抑癌效应。本实验还进一步研究了胡桃醌对AKT的影响，发现胡桃醌对AKT mRNA及AKT蛋白的表达影响不大，但对磷酸化AKT的表达呈现出显著抑制作用，呈浓度依赖性，且胡桃醌处理48 h对磷酸化AKT的抑制作用较24 h时强。这可能是胡桃醌发挥抑制肺癌的机制之一，推测胡桃醌对AKT的影响发挥于翻译后环节。

PIN1是细胞分裂中所必需的，可特异性催化已磷酸化的丝氨酸/苏氨酸-脯氨酰基序发生顺/反异构，从而促进人体细胞生长、增殖、分化及转化［9－10］。PIN1专一性调节构型转变是新发现的蛋白磷酸化后调节机制。AKT是肿瘤增殖信号通路PI3K/AKT中的一个重要节点分子，抑制AKT活性可以抑制肿瘤生长。AKT的完全激活需要苏氨酸Thr-308位点和C末端的丝氨酸Ser-473、酪氨酸Tyr-474位点的磷酸化，磷酸化的丝氨酸Ser-473能较好的反映AKT的活性度［4］。AKT含有丝氨酸/苏氨酸基序，磷酸化的AKT可被PIN1调节顺反构象从而增加磷酸化AKT的稳定性及活性［4］。PIN1的蛋白磷酸化后调节作用可能是PIN1抑制剂胡桃醌仅抑制磷酸化AKT表达而不减少AKT mRNA及AKT表达的原因。本实验结果提示通过抑制PIN1表达从而调节AKT的活性可能是胡桃醌发挥抑制肺癌作用的分子机制。这为胡桃醌成为新型化疗药物提供理论基础，为进一步研究PIN1作为肺癌治疗靶点提供实验依据。

［1］Lu KP，Hanes SD，Hunter T，et al．A human peptidyl-pmlyl isomerase essential for regulation of mitosis［J］．Nature，1996，380:544－547．

［2］He J，Zhou F，Shao K，et al．Overexpression of Pin1 in non-small cell lung cancer(NSCLC)and its correlation with lymph node metastases［J］．Lung Cancer，2007，56:51－58．

［3］Tan XG，Zhou F，Wan JT，et al．PIN1 expression contributes to lung cancer prognosis and carcinogenesis［J］．Cancer Biology＆ Therapy，2010，9:1－9．

［4］Liao Y，Wei Y，Zhou X，et al．Peptidyl-prolyl cis/trans isomerase PIN1 is critical for the regulation of PKB/AKT stability and activation phosphorylation［J］．Oncogene，2009，28:2436－2445．

［5］张秀梅，肖建英，刘超．9-顺式维甲酸对甲状腺鳞癌细胞周期及CyclinD1、CDK4表达的影响［J］．基础医学与临床，2012，32:186－190．

［6］雷蕊霞，周向东．血红素加氧酶-1抑制香烟烟雾提取物致人肺A549细胞黏液高分泌［J］．基础医学与临床，2010，30:246－251．

［7］Mathur R，Chandna S，KapoorV PN，et al．Peptidyl prolyl Isomerase，Pin1 is a potential target for enhancing the therapeutic efficacy of etoposide［J］．Curr Cancer Drug Targets，2011，11:380－392．

［8］Catanzaro J，Wei XZ，Pinpointing Pin1 in non-small cell lung carcinoma［J］．Cancer Biol＆ Ther，2010，9:1 －2．

［9］Lu KP，Zhou XZ．The prolyl isomerase PIN1:a pivotal new twist in phosphorylation signalling and disease［J］．Nat Rev Mol Cell Biol，2007，8:904 －916．

［10］Mathur R，Suman S，Beaume N，et al．Interaction and structural modification of topoisomerase IIalpha by peptidyl prolyl isomerase，pin1:an in silico study［J］．Protein Pept Lett，2010，17:151－163．