ACE、CYP11B2和 α-ADDUCIN基因多态性与福建汉族高血压相关性的分析

林慧中，陈 慧，吴小盈，陈 燕，李德育，陈喜军

(1.福建医科大学附属协和医院心内科，福建福州350004;2.福建省立医院，福建福州350003;3.厦门中山医院，福建厦门361000)

血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme，ACE)、醛固酮合成酶(aldosterone synthase，CYP11B2)、α-内收蛋白(α-ADDUCIN)基因多态性通过影响肾素-血管紧张素-醛固酮系统及细胞膜纳泵活性，导致血压升高。目前国内外关于上述3个基因的单个基因与高血压相关性的研究结论不一，近期的一些不同样本范围的关于上述3个基因单个基因与高血压关系的meta分析也显示出不同的结果［1－6］。这虽然可能与研究的样本量、方法、种族、地域差别有一定关系，但也与原发性高血压是多基因及多环境因素疾病有关。每个基因所产生的微小表型效应可能还不至于引起疾病的发生，但多个基因所产生的微小表型效应积累则可能引起疾病的发生，因此对多个易感基因之间的协同作用进行研究有一定的实际意义。本文采用病例对照设计，选取福建地区汉族高血压及血压正常者进行基因多态性测定，我们旨在探讨ACE基因(I/D)、CYP11B2基因-344T/C、α-ADDUCIN基因460G/T多态性的联合作用与福建汉族原发性高血压的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象

本研究经福建省立医院伦理委员会批准并获得参加者的知情同意及签署知情同意书。

1.1.1 高血压组:入选福建地区汉族人群1380例，其中男女比例821/559，平均年龄60.6±12.24岁。入选标准:根据2005年《中国高血压防治指南》高血压诊断标准:未治疗前非同日3次测量取血压均值，收 缩 压 (systolicblood pressure，SBP)≥140 mmHg和(或)舒张压(diastolic blood pressure，DBP)≥90 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)者;或者既往有高血压史，正在服用降压药者，虽血压＜140/90 mmHg也可入选。排除标准:1)继发性高血压;2)严重贫血、甲亢、心脏瓣膜病、先天性心脏病、心肌病、动静脉瘘、缩窄性心包炎、心包积液、严重的心律失常、周围血管疾病、心肌梗死、充血性心衰及患严重心、脑、肾疾病不能耐受的检查者。

1.1.2 血压正常组:入选福建地区汉族人群888例，其中男女比例522/366，平均年龄59.7±12.0岁。入选标准:根据2005年《中国高血压防治指南》SBP＜140 mmHg，DBP ＜90 mmHg者，常规化验无异常，无各类心血管、脑血管、肾、内分泌等方面疾病。

1.2 主要试剂

DNA提取试剂盒(厦门泰京生物科技有限公司);PCR 反应液，4×d NTP:2.5 mmol/L，BmgT120限制性内切酶，HaeⅢ限制性内切酶，DNA Marker DL2000，引物，琼脂糖(宝生物工程大连有限公司)。

1.3 基因检测

1.3.1 血标本的收集:抽取受试者静脉血2 mL，提取基因组DNA。

1.3.2 基因检测:ACE基因:目的片段多聚酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增参照Rigat［7］首先设计的引物序列，上游引物:5'-CTGGA GACCACTCCCATCCTTTCT-3'，下游引物:5'-GATG TGGCCATCACATTCGTCAGAT-3'。95℃ 预 变 性5 min;95℃变性30 s→58℃退火30 s→72℃延伸50 s，共30个循环;最后72℃延伸10 min。PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定分型(图1)。CYP11B2基因:PCR扩增引物自行设计，上游引物:5'-CAGGAGGA GACCCCATGTGAC-3'，下游引物:5'-CCTCCACCCTGTTCAGCCC-3'。95℃预变性5 min;95℃变性30 s→60℃退火30 s→72℃延伸30 s，共40个循环;最后72℃延伸5 min。将PCR产物用HaeⅢ内切酶进行酶切，37℃水浴，6～8 h，酶切位点为。酶切产物进行3%琼脂糖凝胶电泳鉴定分型(图2)。α-ADDUCIN基因:PCR扩增引物自行设计，上游引物:5'-CAGCGATGTGGAGGTTC CTG-3'下游引物:5'-TGGGACTGCTTCCATTCGGC-3'。95℃预变性5 min;95℃变性30 s→60℃退火30 s→72℃延伸30 s，共36个循环;最后72℃延伸5 min。将PCR产物用BmgT120内切酶进行酶切，37℃水浴，过夜，酶切位点为:。酶切产物进行3%琼脂糖凝胶电泳鉴定分型(图3)。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 一般资料比较及Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验

高血压组与对照组之间年龄、性别分布经检验无统计学差异。经检验3种基因基因型分布频率观测值与预计值差异不显著，符合Hardy-Weinberg遗传平衡。

2.2 单基因多态性分析

ACE、CYP11B2、α-ADDUCIN 基因各基因型在高血压(EH)组和对照(C)组间无差异(表1)。因表格限制，将 CYP11B2、α-ADDUCIN简写为 CYP、ADD，下同。

2.3 联合基因多态性分析

2.3.1 合并CYP11B2基因CC和TC基因型:CYP11B2基因的CC型例数较少 (高血压组93例，血压正常组73例)，故将CC型与TC型合并，代表携带有C等位基因者，以减少因例数太少引起的误差。

2.3.2 两两基因联合分析:具有ACE-DD+ADDUCIN-TT基因型在高血压组分布频率较高(P＜0.05)，进一步计算 OR(95%CI)值为1.81(1.09，3.01)(P＜0.05)。具有 ACE-DD+CYP11B2-TC/CC基因型在高血压组分布频率较高(P＜0.05)，进一步计算OR(95%CI)值为1.61(1.15，2.27)(P＜0.01)(表2)。

2.3.3 3基因联合分析:具有ACE-DD+CYP11B2-TC/CC+ADDUCIN-TT基因型在高血压组分布频率较高(P＜0.05)，进一步计算 OR(95%CI)值为2.82(1.41－5.65)(P＜0.01)(表3)。

表2 两基因联合分析Table 2 Genotype conjoint analyses between two genes

表3 3基因联合分析Table 3 Genotype conjoint analyses between three genes

3 讨论

ACE基因第16位内含子序列中一段ALU序列的插入或缺失，形成I/D多态性，进而影响血中血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)水平。AngⅡ是一种升血压物质，能使阻力血管和容量血管收缩，灭活舒血管物质缓激肽，使血压升高。CYP11B2基因的-344T/C突变位于CYP11B2基因类固醇生成转录因子1(SF-1)结合区，该变异影响醛固酮的合成分泌，醛固酮的过度分泌可使体内水、电解质平衡失调，水、钠潴留，血容量增加，血压升高。α-ADDUCIN基因上氨基酸替换(Gly→Trp)的结果可能影响内收蛋白组装或其稳定性，从而改变了细胞膜骨架结构和钠离子跨膜转运，引起近端肾小管钠离子重吸收增加，水钠潴留，循环血容量增加，导致血压升高。上述3个基因在机制上可有互相协同的作用。如ACE可刺激醛固酮的分泌;α-ADDUCIN基因突变可引起近端肾小管钠离子重吸收增加，水钠潴留，与醛固酮引起的水钠潴留有协同作用，引起血容量增加，血压升高。因此3个基因协同作用增加了水钠潴留的作用，导致血压升高。

国内一项研究单独分析α-ADDUCIN基因与高血压关系，未提示相关性，但联合其他基因后显示出了与高血压相关性，说明基因协同作用［8］。本研究通过基因联合分析显示了基因的协同作用。单基因分析时各个基因与高血压无显著性相关，但对3个基因联合分析后，显示出了与高血压的相关性。同时携带ACE-DD和ADD-TT基因型，ACE-DD+CYPTC/CC基因型及ACE-DD+CYP-TC/CC+ADD-TT基因型的人患高血压风险增高。且3基因联合分析较两个基因联合分析时，OR值明显升高，进一步说明了基因的协同作用。一项研究分析了479例中国汉族人的血压与ACE、CYP11B2、α-ADDUCIN 3个基因联合作用后得出，ACE-DD+CYP11B2-CC基因型或ACE-DD+α-ADDUCIN-TT基因型者的收缩压较高［9］;一项在高加索人中进行的队列研究中表明，同时携带有ACE-DD基因型、α-ADDUCIN基因T等位基因、CYP11B2-CC基因型的人有更高的高血压发生率［10］。均与本研究结果一致。

本研究尚存在一定局限性，高血压是多基因与多环境因素共同参与的疾病，目前，关于原发性高血压候选基因的研究正不断深入，尚需有关联合环境等多因素的进一步研究。

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