梯度洗脱高效液相色谱法测定辛伐他汀分散片的含量和有关物质

付莉娜 ，郑金琪 ，郑国钢 ，陶巧凤 ，

(1.浙江工业大学药学院，浙江 杭州 310014;2.浙江省食品药品检验研究院，浙江 杭州 310004)

辛伐他汀为羟甲基戊二酰辅酶A(HMG－CoA)还原酶抑制剂[1]，可阻断胆固醇的生物合成[2]，对高胆固醇血症、混合型高脂血症、冠状动脉粥样硬化性心脏病和脑中风的防治等有明显的疗效[3－4]，是一种高效的调血脂药。辛伐他汀分散片可在水中迅速崩解成均匀的混悬液，具有服用方便、吸收快、生物利用度高等特性[5]。但辛伐他汀分子结构中含有不稳定基团4－羟基－2H－6氧合－吡喃环，容易被氧化[6]，在生产和贮藏过程中亦可能产生降解物，因而一般在制剂处方中加入抗氧化剂(常用的是叔丁基－4－羟基－茴香醚和抗坏血酸)，以增加辛伐他汀的稳定性。经查阅，其国家药品标准中未进行有关物质检查[7]。笔者参考文献[8]和2010年版《中国药典(二部)》[9]辛伐他汀片的质量标准，经方法学研究，建立了测定辛伐他汀分散片含量和有关物质的梯度洗脱高效液相色谱(HPLC)法。

1 仪器与试药

Waters高效液相色谱仪(2695泵，2996二极管阵列紫外检测器);Empower色谱工作站;Mettler AE 240型电子天平。洛伐他汀对照品(批号为100600－200301)和辛伐他汀对照品(批号为100601－200502)由中国食品药品检定研究院提供;辛伐他汀铵(分析纯，浙江江北药业有限公司);辛伐他汀分散片(规格为每片10mg，批号为3134825;规格为每片20mg，批号为3134839;规格为每片40mg，批号为3134830)为广州南新制药有限公司产品;乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Supelco C18柱(33mm×4.6mm，3μm);流动相:A 为乙腈－0.1%磷酸溶液(50∶50)，B为含0.1%磷酸乙腈溶液，梯度洗脱程序见表1;流速:3.0mL/min;检测波长:238 nm。取辛伐他汀对照品约20mg，置50mL容量瓶中，加0.2mol/L氢氧化钠溶液－乙腈(1∶1)的混合溶液5.0mL，振摇使溶解，放置5min，加稀盐酸中和后用2.2项下溶剂稀释至刻度，得含开环降解物辛伐他汀酸的溶液，取5.0mL以及洛伐他汀与辛伐他汀对照品各约2mg，置同一100mL容量瓶中，加2.2项下溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性试验溶液。取10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果辛伐他汀酸峰与洛伐他汀峰的分离度应大于4.0，理论板数按辛伐他汀峰计算不低于2 000。

表1 流动相梯度洗脱程序

2.2 溶液制备

有关物质:取本品细粉适量(约相当于辛伐他汀80mg)，精密称定，置100mL容量瓶中，加溶剂[0.01mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH至4.0)－乙腈(40∶60)]溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液;精密量取1.0mL，置100mL容量瓶中，加上述溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。

含量测定:称取辛伐他汀对照品约10mg，精密称定，置100mL容量瓶中，加上述溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液;取本品细粉适量(约相当于辛伐他汀10 mg)，精密称定，置100mL容量瓶中，加上述溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 有关物质

专属性试验:取依处方比例混合的辅料适量，依2.2有关物质项下方法制备成辅料溶液，分别取2.2项下溶剂、辅料溶液、系统适用性溶液各10μL进样。结果见图1。可见，溶剂对测定无干扰，辅料出峰时间在0.6min以内，在相对主峰保留时间的0.3倍内;辛伐他汀酸、洛伐他汀和辛伐他汀的出峰时间分别为1.256，1.473，2.135min，辛伐他汀酸峰与洛伐他汀峰之间的分离度为1.6，洛伐他汀峰与辛伐他汀峰之间的分离度大于5.0。

图1 高效液相色谱图

强制破坏试验:取批号为3134830的样品粉末5份，每份约含辛伐他汀40mg，分别置50mL量瓶中，加2.2项下溶剂10mL，振摇使辛伐他汀溶解。分别加入1.0mol/L盐酸溶液5.0mL，放置24 h，加 1.0 mol/L 氢氧化钠溶液 5.0mL 中和后，加 2.2项下溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为酸破坏供试品溶液;加入 1.0mol/L 氢氧化钠溶液 5.0mL，放置 24 h，加 1.0mol/L 盐酸溶液5.0 mL中和后，加2.2项下溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为碱破坏供试品溶液;加入10%过氧化氢溶液5.0mL，放置 24 h，加 2.2 项下溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为氧化破坏供试品溶液;在(4 500±500)lx光照强度下放置24 h，加2.2项下溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为光照破坏供试品溶液;在60℃水浴中加热6 h，放冷，加2.2项下溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为热破坏供试品溶液。按2.1项下色谱条件进样测定，结果见图2。可见，辛伐他汀主峰与强制破坏降解产物均能获得很好的分离。

图2 强制破坏试验高效液相色谱图

相对响应因子测定:洛伐他汀是合成辛伐他汀的起始物料，辛伐他汀酸是辛伐他汀的降解产物。辛伐他汀酸极不稳定物质，故使用其稳定的铵盐辛伐他汀铵进行试验。结果洛伐他汀与辛伐他汀的相对响应因子为1.02，辛伐他汀酸与辛伐他汀的相对响应因子为 0.92。

检测限测定:取含辛伐他汀、洛伐他汀与辛伐他汀酸的对照品溶液，逐步稀释，测得辛伐他汀、洛伐他汀与辛伐他汀酸的检测限分别为 25.14 ng/mL(S/N≈4.6)，20.04 ng/mL(S/N≈2.7)和 27.16 ng/mL(S/N≈3.9)。

稳定性试验:取批号为3134825的供试品溶液，分别于0，1，3，6，12 h时进样，测定有关物质。结果见表2。可见，供试品溶液在12 h内有关物质有所增加，但在6 h内基本稳定，故建议在供试品溶液制备3 h内测定。

表2 有关物质测定溶液稳定性试验结果

2.3.2 含量测定

线性关系考察:取辛伐他汀对照品约10 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加2.2项下溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为标准贮备液;精密量取 0.2，0.5，0.8，1.0，1.2，1.5，1.8mL，分别置10mL容量瓶中，用2.2项下溶剂稀释至刻度，摇匀，取10μL注入液相色谱仪，记录色谱图，以质量浓度 C(μg/mL)对峰面积A作标准曲线，线性回归方程为 A=12 493C+2 199，r=0.999 9(n=7)。结果表明，辛伐他汀质量浓度在 20.02～180.2 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

精密度试验:取批号为3134825的样品，于同一日内及不同日内依法分别连续测定含量6次，得日内和日间精密度。结果辛伐他汀的含量为 93.5% 和 93.8% ，RSD 为 0.59% 和 0.69%(n=6)，表明方法精密度良好。

回收率试验:取处方量辅料，另取辛伐他汀对照品适量，按2.2项下方法分别制备成高、中、低3种不同质量浓度的溶液(120%，100%，80%)各3份，分别取上述溶液各10μL，注入液相色谱仪，以外标法测定含量并计算回收率。结果平均回收率为99.9% ，RSD 为 0.51%(n=9)。

2.4 样品测定

有关物质:取样品3批，按2.2项下方法分别制备成供试品溶液和对照溶液。精密量取对照溶液10μL注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20%;再精密量取供试品溶液和对照溶液各10μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液色谱图中如显杂质峰，扣除相对主峰保留时间0.3倍内的辅料峰，单个杂质峰面积不得大于对照溶液的主峰面积(1.0%)，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的3倍(3.0%)，供试品溶液中任何小于对照溶液主峰面积0.05倍的峰可忽略不计。结果见表3。

含量测定:取样品3批，按2.2项下方法分别制备成对照品溶液和供试品溶液。精密量取10μL注入液相色谱仪，按外标对照品法测定含量。结果见表3。

3 讨论

辛伐他汀含六元内酯环等不稳定基团，易被氧化和水解，在生产和贮藏过程中亦可能产生降解产物，而现行国家药品标准中未进行有关物质检查。本试验中参考2010年版《中国药典(二部)》辛伐他汀片标准，对3批样品进行了有关物质检查，结果单个杂质 0.20% ～0.33%，杂质总量 0.64% ～0.77%，故有必要对其有关物质进行控制。辛伐他汀是不稳定物质，对酸、碱、热和氧化均不稳定，市售辛伐他汀分散片的有效期为2年，考虑到产品在有效期内的降解空间，建议限度订为单个杂质不得过1.0%，杂质总量不得过3.0%。

由试验结果可知，洛伐他汀、辛伐他汀酸与辛伐他汀的相对响应因子在0.90～1.10范围内，为方便试验，采用以洛伐他汀和辛伐他汀酸外标定位(系统适用性试验)，以辛伐他汀为自身对照测定有关物质。

厂家在辛伐他汀分散片处方中加入了抗氧化剂以增加稳定性，抗氧化剂的保留时间在相对主峰保留时间0.3倍内;同时，对辛伐他汀原料药亦进行了降解试验，结果在相对主峰保留时间0.3倍内基本无降解杂质峰。因此，拟在有关物质测定时，扣除相对主峰保留时间0.3倍内的辅料峰后，测定辛伐他汀分散片的最大单个杂质和杂质总量。

表3 样品有关物质及含量测定结果

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