虎杖中虎杖苷和白藜芦醇含量标准值与不确定度评估分析方法研究

刘淑聪，张宝喜，杨世颖，马 林，吕 扬

(北京协和医学院·中国医学科学院药物研究所，药物晶型研究中心，晶型药物研究北京市重点实验室，北京 100050)

虎杖为蓼科植物虎杖 Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的干燥根茎及根，主要有效成分为蒽醌类及芪类化合物，具有清热解毒、利胆退黄、祛风利湿、散瘀定痛、止咳化痰的功效，属常用中药材品种[1]。中药材的质量控制一直是困扰中药研究与应用的技术难点和重点科学问题，而其中应用到的多种仪器技术与分析方法尚缺少大量的科学实验和数据加以验证。因此，中药有效、定量、准确的质量控制技术和方法属我国亟待解决的重要科学问题。国际上对药品质量控制的趋势已从仅提供药物的有效成分含量值，发展到需要提供药物有效成分的标准值和不确定度值，即将药品的一般标准提升为计量标准，以保证药品质量控制的量值溯源性和准确性。虽已有文献对中药材虎杖成分含量的报道，但目前尚未见关于其成分含量标准值和不确定度评估方法的报道。现将国际计量标准研究引入到对我国中药复杂体系成分的含量研究中，通过国家一级有证计量标准物质虎杖苷化学纯度标准物质(GBW09566)、白藜芦醇化学纯度标准物质(GBW09536)的量值传递，实现对中药材虎杖中两种成分的含量标准值及不确定度评价研究，旨在对我国现有分析技术和方法进行补充和完善。本研究中选用的安徽产虎杖中药材，经质量检查符合2010年版《中国药典(一部)》的要求[2]，研究方法则依据《中华人民共和国计量法》《一级标准物质研制技术规范》(JJF1006－1994)及《标准物质管理办法》等[3－5]相关技术文件的要求。现报道如下。

1 仪器和试药

美国Agilent 1200型高效液相色谱仪，包括DAD检测器、Agilent chemstation工作站;Mettler XS105型分析用天平(感量0.01mg);SHH.W21.420型三用电热恒温水箱(北京精科华瑞仪器有限公司)。国家一级标准物质:虎杖苷化学纯度标准物质，编号为 GBW 09566，纯度标准值及不确定度值为(99.6±0.7)%(k=2，P=0.95);白藜芦醇化学纯度标准物质，编号为GBW09536，纯度标准值及不确定度值为(99.4 ±0.5)%(k=2，P=0.95)。虎杖中药材，产地安徽，经中国医学科学院药物研究所马林教授鉴定为正品，样品经除尘、粉碎、并过50目筛，备用;精密称取1 g样品，置棕色安瓿瓶密封包装，共完成了500支最小包装1 g量的中药材虎杖成分分析标准物质候选物样品的制备工作。甲醇(Fisher Chemical，色谱纯);无水乙醇(分析纯，北京化工厂);娃哈哈饮用纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。

2 方法与结果

2.1 含量测定(高效液相色谱法)

2.1.1 色谱条件[6－7]

色谱柱:Agilent XDB C18(250 mm×4.6 mm，5μm);流动相:甲醇 －水(40∶60);流速:1.0mL/min;柱温:25℃;进样量:10μL;检测波长:306 nm。

2.1.2 溶液制备

精密称取虎杖苷、白藜芦醇化学纯度标准物质适量，分别置50mL容量瓶中，用50%乙醇将样品完全溶解，并定容至刻度，摇匀，配制成每1mL溶液中分别含虎杖苷166μg，白藜芦醇145μg的标准储备液。精密移取 0.1，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 mL 分别置10mL容量瓶中，用50%乙醇稀释至刻度，得虎杖苷质量浓度分别为 1.66，8.29，16.60，33.20，82.90，166.00 μg/mL，白藜芦醇质量浓度分别为 1.45，7.23，14.50，28.90，72.30，145.00 μg/mL标准溶液。取中药材虎杖约100mg，精密称定，精密加入50%乙醇25mL，称定质量，加热回流30min，冷却至室温，再称定质量，用50%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.1.3 方法学考察

系统适用性试验:分别吸取虎杖苷、白藜芦醇标准溶液和供试品溶液按拟订的色谱条件进样，色谱图见图1。可见，虎杖苷与白藜芦醇的分离度好，且周围无其他色谱峰干扰，表明拟订的色谱条件可行。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察:分别精密移取6种不同质量浓度的标准溶液10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图及峰面积，以标准溶液的质量浓度(X)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归。虎杖苷色谱峰面积值分别为 69.18，354.3，709.5，1 461，3 592，7 227，回归方程为 Y=43.604X －4.880 2，r2=1.000 0(n=6);白藜芦醇色谱峰面积值分别为 108.6，520.0，1 063，2 125，5 351，10 766，回归方程为 Y=74.533X －17.083，r2=1.000 0(n=6)。结果表明，虎杖苷和白藜芦醇质量浓度分别在1.7～165.7μg/mL和1.5～144.5μg/mL范围内与峰面积呈良好线性关系。

精密度试验:精密吸取虎杖苷、白藜芦醇的标准贮备液1mL，置10mL容量瓶，50%乙醇稀释至刻度，按拟订的色谱条件重复进样6次，记录色谱图;结果虎杖苷峰面积值分别为714.8，715.3，714.4，715.5，715.7，716.0，白藜芦醇峰面积值分别为1 066，1 072，1 065，1 071，1 066，1 065，RSD 分别为 0.08% 和0.30%(n=6)，表明仪器精密度良好。精密移取虎杖苷与白藜芦醇的标准储备液1mL，置10mL容量瓶中，各6份，用50%乙醇稀释至刻度，按拟订的色谱条件各重复进样3次，分别记录色谱图;结果虎杖苷峰面积均值分别为 713.1，715.1，713.1，715.2，714.6，712.3，白藜芦醇峰面积均值分别为 1 068，1 051，1 065，1 062，1 064，1 065，RSD 分别为 0.17% 和 0.54%(n=6)，表明方法精密度良好。

重复性试验:称取中药材虎杖样品6份，每份100mg，依法制备供试品溶液，按拟订的色谱条件进样测定。结果虎杖苷相对百分含量分别为 1.486% ，1.486% ，1.504% ，1.500% ，1.489% ，1.481%，平均含量为 1.491%，RSD 为 0.60%(n=6);白藜芦醇相对百分含量分别为 0.298% ，0.294% ，0.292% ，0.292% ，0.294% ，0.290% ，平均含量为 0.293% ，RSD 为 1.03%(n=6)，可见，供试品溶液制备方法重现性良好。

稳定性试验:取同一供试品溶液，避光放置，分别于配制后0，4，8，12，16，24 h 时[5－6]依法进样测定。结果虎杖苷相对百分含量 分 别 为 1.491% ，1.494% ，1.496% ，1.488% ，1.499% ，1.483%，RSD为0.38%(n=6);白藜芦醇相对百分含量分别为0.300% ，0.304% ，0.298% ，0.307% ，0.301% ，0.306% ，RSD 为1.19%(n=6)。可见供试品溶液在24 h内稳定性良好。

回收率试验:称取中药材虎杖样品6份，每份100mg，再加入已知含量的标准物质(虎杖苷1.49%，白藜芦醇0.29%)，按供试品溶液制备方法制备溶液并依法测定含量，计算回收率。结果虎杖苷回收率分别为 98.52% ，99.72% ，99.24% ，99.39% ，99.15% ，98.86%，平均 99.15%，RSD 为 0.42%(n=6);白藜芦醇回收率分别为 99.76%，99.87%，98.96%，99.34%，99.89%，99.72%，平均99.59%，RSD 为 0.37%(n=6)。可见，方法回收率良好。

2.1.4 均匀性试验

从500支中药材虎杖标准物质候选物中随机抽取15瓶样品，每瓶样品均按供试品溶液制备方法制备溶液，按拟订的色谱条件测定含量，共获得45个均匀性检验数据，见表1。采用单因素方差分析[7－8]对均匀性检验数据进行组内和组间统计分析，测定虎杖苷含量时 F值为1.71，测定白藜芦醇含量时 F值为1.63，F0.05(14，30)=2.04，即 F ＜ F0.05(14，30)。结果表明，中药材虎杖成分分析标准物质样品具有良好的均匀性。

表1 虎杖中虎杖苷和白藜芦醇含量均匀性检验数据

2.1.5 长期稳定性试验

将密封包装后的标准物质候选物样品放置在常温条件下长期保存，考察其稳定性，并分别于 0，1，2，4，6，12 月时随机抽样，每个点随机抽样6瓶，依法测定虎杖苷和白藜芦醇含量。测定结果见表2。以保存时间(X)，成分含量(Y)分别拟合两种化学成分的直线，得直线回归方程，计算斜率的不确定度[8－9]，结果如下。虎杖苷Y=0.000 005X+0.0149，白藜芦醇 Y= －0.000 000 8X+0.003，

表2 虎杖中虎杖苷和白藜芦醇成分含量长期稳定性数据

二者的自由度均为 n－2=6－2=4和 P=0.95(95%置信区间)的 t因子等于2.776，由于虎杖苷和白藜芦醇含量测定值|a|＜×S(a)，故斜率是不显著的，表明中药材虎杖成分分析标准物质候选物在12个月内的稳定性良好。

2.2 成分含量标准值及不确定度评估

2.2.1 成分含量标准值定值

依据国家一级标准物质技术规范的定值，采用6家实验室联合定值方法实现对中药材虎杖中虎杖苷和白藜芦醇成分进行定值。结果见表3。采用格拉布斯检验，剔除可疑值，并采用科克伦(Cochran)等精度检验，证明虎杖苷含量和白藜芦醇含量的测量数据均属等精度数据。计算得6家联合定值的中药材虎杖中虎杖苷含量标准值 P1=1.473%，S1=0.000 021 4;白藜芦醇含量标准值 P2=0.294%，S2=0.000 026 6。

2.2.2 不确定度评定

1)成分含量标准值的不确定度评估

经分析可知，其标准值的总不确定度由5个部分组成:由虎杖苷和白藜芦醇国家一级标准物质引入的不确定度值;由测量数据的不确定度引入的不确定度，包括了中药材中有效成分提取及含量测定过程引入的不确定度;由联合定值的标准曲线拟合引入的不确定度;由样品不均匀性引入的不确定度;由样品稳定性引入的不确定度。这5个部分不确定度构成标准值的总不确定度[8－11]。

表3 虎杖中虎杖苷和白藜芦醇成分含量的联合定值数据

2)不确定度的量化分析

国家一级标准物质引入的不确定度值 urel(p):虎杖苷纯度标准物质的量值为(99.6±0.7)%，标准不确定度值为0.7%/2=0.35% ，相 对 标 准 不 确 定 度 值 为 urel(p1)=0.35%/99.6%=0.003 514。白藜芦醇纯度标准物质的量值为(99.4 ±0.5)%，其标准不确定度值为0.5%/2=0.25%，相对标准不确定度值为urel(p2)=0.25%/99.4%=0.002 515。测量数据的不确定度值urel(j)。

联合定值的标准曲线拟合引入的不确定度值 urel(f):按照国际标准化组织标准物指南35(以下简称指南35)规定，标准曲线拟合的标准偏差计算公式为 urel(f)=u(c1)/c1。

S(A)为标准溶液峰面积的标准偏差，m为中药材虎杖溶液的测定次数，n为标准溶液的总测定次数，C0为标准溶液的质量浓度(μg/mL)，C1为中药材虎杖溶液的质量浓度(μg/mL)，i为校准溶液的第 n次测量。以检测样品的溶液质量浓度为 X、峰面积 Y拟合标准曲线而获得直线。联合标定单位的标准曲线相对不确定度 urel(f)值结果见表4，取其中的最大值计算。

表4 联合定值标准曲线引入的相对不确定度数据

样品均匀性引入的不确定度 urel(SH):由均匀性产生的不确定度可按照指南35规定，数学模型为

式中 SH表示均匀性产生的不确定度，n表示测定次数，MS组间表示组间均方差，MS组内表示组内均方差。表5给出中药材虎杖中虎杖苷和白藜芦醇成分含量均匀性产生的不确定度数据，其中虎杖苷为 5.32 ×10－5，白藜芦醇为 2.32 ×10－5，与测量产生的不确定度相比，均匀性产生的不确定度较小，可以忽略。

表5 虎杖中虎杖苷和白藜芦醇成分含量均匀性产生的不确定度数据

样品稳定性引入的不确定度 urel(St):

式中 S(α)表示斜率产生的不确定度，S表示直线的标准偏差，Xi表示时间点，表示时间均值，St表示稳定性产生的不确定度，t表示时间。由稳定性产生的不确定度值，虎杖苷 urel(St1)=12 × Sα1=1.64×10－4;白藜芦醇 urel(St2)=12 ×Sα2=1.68 × 10－5。3)合成标准不确定度计算

式中，uc(x)表示前3部分合成标准不确定度，urel(p)表示国家一级标准物质引入的不确定度值，urel(j)表示测量数据引入的不确定度值，urel(f)表示联合定值的标准曲线拟合引入的不确定度值。计算合成标准不确定度，虎杖苷 uc(x1)=0.006 76%，白藜芦醇 uc(x2)=0.003 79%。

4)总合成标准不确定度

式中，uc(总)表示总合成标准不确定度，uc(x)表示前3部分合成标准不确定度，urel(SH)表示样品均匀性引入的不确定度，urel(St)表示样品稳定性引入的不确定度。计算总合成标准不确定度，虎杖苷 uc(总1)=0.0001855，白藜芦醇 uc(总2)=0.000047 5。

5)扩展不确定度

数学模型:U=k×uc(总)。式中，U表示扩展不确定度，k表示包含因子，uc(总)表示总合成标准不确定度。k取2，P=95%，计算扩展不确定度，虎杖苷 U1=0.037 1%，白藜芦醇 U2=0.009 5%。

6)成分含量标准值及不确定度表示

在测量不确定度的最终计算中，一般采用只进不舍的规则。故中药材虎杖中，虎杖苷含量标准值及不确定度值为(1.47±0.04)%，k=2，P=0.95;白藜芦醇含量标准值及不确定度值为(0.29 ±0.01)%，k=2，P=0.95。

3 讨论

本研究成功地赋予复杂体系中药材虎杖中虎杖苷和白藜芦醇含量的标准值及不确定度值，为国际公认的有证计量标准物质研制，提供了有效的检测技术、全面的计算数学模型、标准值和不确定度的评估方法，对我国标准物质研制具有较好的技术示范作用。

中药材有证国家级标准物质研究在我国刚刚起步，本研究将为我国中药材乃至中成药的质量标准提高、与国际公认的计量标准技术接轨、推动中药的标准化和现代化，提供了标准物质、物质标准、标准技术方法。

[1]林 莉.虎杖在民族医药中的应用[J].中国药业，2007，16(18):52.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社，2010:附录ⅨK.

[3]JJF1066－1994，中华人民共和国国家计量技术规范·一级标准物质[S].

[4]全 浩，韩永志.标准物质及其应用技术[M].第2版.北京:中国标准出版社，2003:738.

[5]全国化工标准物质委员会.分析测试质量保证[M].沈阳:辽宁大学出版社，2004:232.

[6]李 谦，王 霞.HPLC色谱法同时测定川产虎杖中白藜芦醇、白藜芦醇苷及大黄素苷的含量[J].数理医药学杂志，2011，24(2):219－222.

[7]邹盛勤.反相高效液相色谱法测定虎杖根中白藜芦醇及其苷的含量[J].生命科学仪器，2011，9(6):37－39.

[8]徐维盛，杨德智，张 丽，等.丹皮酚化学纯度标准物质研制与定值分析方法研究[J].医药导报，2011，30(2):143－148.

[9]周浩辉，周政政，郭永辉.岩白菜素化学纯度标准物质的定值及不确定度评价研究[J].中国药房，2012(23):1 005－1 009.

[10]胡 坪，罗国安，赵中振，等.人参中人参皂苷HPLC定量方法的测量不确定度的评定[J].药学学报，2005，40(1):53.

[11]宋增峰，马 辰.虎杖中总蒽醌含量测定不确定度的评定[J].分析实验室，2007，26(Suppl1):294 －297.