妊娠相关蛋白在多囊卵巢综合征早期自然流产患者的表达及临床意义

郝 明，周 楠，胡兴茂，王庆琴

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是最常见的妇科内分泌疾病之一，临床主要表现为高雄激素血症、持续不排卵和胰岛素抵抗［1］，也是引起无排卵性不孕的最常见原因。PCOS患者不仅表现为不孕，且早期自然流产率也较高，表现为妊娠3个月内流产［2］。有研究显示，PCOS患者早期自然流产率是正常女性的3倍［3］。目前其原因尚不清楚，但是随着研究的深入，我们发现子宫内膜功能的改变可能发挥了重要的作用，从而影响正常胚胎的发育而导致流产［4］。胰岛素抵抗与高胰岛素血症引起PCOS患者流产的机制尚不明确，但我们推测可能与胰岛素抵抗与高胰岛素血症导致子宫内膜分泌人妊娠相关蛋白(glycodelin)减少，循环血中glycodelin浓度降低，导致子宫内膜环境的改变有关。因此本研究对妊娠3个月内的PCOS患者以及正常女性进行了横断面研究，以期为PCOS的临床研究和流产的治疗提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2012年4月—2013年4月在我院妇科门诊就诊并确诊为妊娠3个月内(孕周＜12周)流产的PCOS 77例为试验组，均符合鹿特丹标准［5］，即以下3项中至少存在2项:①稀发排卵或无排卵;②高雄激素血症或高雄激素的临床表现(如多毛、痤疮等);③在月经周期或黄体酮撤退后出血3～5 d行超声检查，显示双侧卵巢均有≥12个且直径为2～9 mm的小卵泡和(或)卵巢体积增大＞10 ml。此外，诊断时还需除外引起高雄激素血症的其他原因，如高泌乳素血症和甲状腺疾病、先天性肾上腺皮质增生、库欣综合征、雄激素分泌性肿瘤、21-羟化酶缺乏性非典型肾上腺皮质增生、外源性雄激素应用等。所有患者均为自然受孕，排除辅助受孕者;孕6～12周，彩超提示胚胎停止发育，均排除孕期感染及有害物质接触史;夫妇双方染色体正常，无严重全身性疾病;男方精液检查正常。随机选择同期正常孕期(孕＜12周)要求流产的妇女68例作为对照组。所有观察对象排除内分泌疾病，3个月内无激素用药史。根据胎龄将试验组和对照组分别分为孕3～5周，孕6～8周，孕9～11周。两组不同孕周年龄、体重指数比较差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性，见表1。

表1 2组不同孕周流产患者一般资料比较(±s)

表1 2组不同孕周流产患者一般资料比较(±s)

注:试验组为多囊卵巢综合征，对照组为正常妊娠要求流产者

一般资料 孕3～5周(n=41)试验组(n=22) 对照组(n=19)孕6～8周(n=53)试验组(n=28) 对照组(n=25)孕9～11周(n=51)试验组(n=27) 对照组(n=14)0.92 28.70 ±0.85 29.60 ±0.77体重指数(kg/m2) 24.40 ±0.33 23.80 ±0.31 24.70 ±0.32 24.60 ±0.2年龄(岁) 28.20 ±0.76 27.60 ±0.82 29.90 ±0.88 28.90 ±9 25.70 ±0.22 25.90 ±0.23

1.2 主要试剂 人睾酮(eestosterone)酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒96T，glycodelin ELISA试剂盒96T，人性激素结合球蛋白(SHBG)ELISA试剂盒96T均购自美国Beckman公司。以上试剂盒不与其他细胞因子有交叉反应。板内、板间变异系数均＜10%。山羊抗人glycodelin抗体(美国Abcam公司)，兔抗山羊辣根过氧化物酶标记二抗(美国Cell Signaling Technology公司)，BCA蛋白定量试剂盒(北京普利莱生物公司)，PVDF膜(Millipore公司)。

1.3 研究方法

1.3.1 母体外周血中glycodelin水平:两组均在黄体中期于清晨空腹抽取静脉血5 ml，置于抗凝管中，3000 r/min离心 10 min，分离上层血清并置于－20℃冰箱保存待测。抽血时测量身高和体重，计算体质量指数(BMI)。采用ELISA法检测glycodelin、空腹胰岛素(fasting insulin)、空腹血糖(fasting glucose)、睾酮(total testosterone)、游离睾酮(free testosterone)和SHBG水平。

1.3.2 蜕膜组织中glycodelin蛋白表达:应用Western blot方法检测蜕膜组织中glycodelin蛋白的表达情况。取两组冷冻的蜕膜组织，加入冰冷细胞裂解液后经机械匀浆，取上清液分装置－80℃保存备用。另取50 μl上清液用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，4℃冷库恒流150 mA、3 h电转移至 PVDF膜，奶粉封闭后加入glycodelin一抗4℃过夜，漂洗后1∶5000稀释辣根过氧化物酶标记兔抗山羊二抗37℃、2 h，ECL增强发光试剂显色后，置暗盒曝光于X胶片上，常规显影、定影。数码相机照相，使用Gel-pro凝胶分析软件，测定各条带的平均光密度值(OD值)，以OD值代表蛋白质的表达量。待测蛋白质表达量与内参照β-肌动蛋白(β-actin)表达量进行对比，表示蛋白质的相对表达水平。

1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件包进行分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，两组比较采用t检验，α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 母体外周血中glycodelin水平 孕3～5周、孕6～8周、孕9～11周母体外周血中glycodelin水平试验组分别为 420.0 ±27.1、443.2 ±26.2、700.3 ±25.8;对照组分别为 876.1 ± 28.2、598.9 ± 19.8、668.6±20.1，试验组孕3～5周和孕6～8周母体外周血中glycodelin的水平与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，但孕9～11周差异无统计学意义(P=0.21)。见图1。

图1 2组流产患者母体外周血中人妊娠相关蛋白表达水平

2.2 蜕膜组织中glycodelin蛋白的表达 将β-actin作为内参照，试验组蜕膜组织中glycodelin蛋白的表达显著低于对照组(图2A)。孕3～5周、孕6～8周和孕9～11周蜕膜组织中glycodelin蛋白检测结果试验组分别为 0.93 ± 0.07、1.01 ± 0.11、1.33 ±0.15;对照组分别为 1.34 ± 0.12、1.33 ± 0.09、1.62±0.13，试验组显著低于同孕周对照组(P ＜0.05)。见图2B。

图2 2组流产患者蜕膜组织中人妊娠相关蛋白表达水平

2.3 代谢性指标 空腹血清胰岛素水平试验组孕3～5周和孕9～11周显著高于同孕周对照组(P＜0.01)，但孕6～8周与同孕周对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。空腹血糖试验组孕3～5周显著高于同孕周对照组(P＜0.01)，但孕6～8周和孕9～11周比较差异无统计学意义(P＞0.05)。不同孕周试验组睾酮和游离睾酮均显著高于对照组(P＜0.01)，而SHBG水平显著低于对照组(P＜0.05)。见表2。

表2 2组不同孕周流产患者代谢性指标比较(±s)

表2 2组不同孕周流产患者代谢性指标比较(±s)

注:试验组为多囊卵巢综合征，对照组为正常妊娠要求流产者;与同孕周对照组比较，aP＜0.05，bP＜0.01

一般资料 孕3～5周(n=41)试验组(n=22)对照组(n=19)孕6～8周(n=53)试验组(n=28)对照组(n=25)孕9～11周(n=51)试验组(n=27)对照组(n=14)空腹胰岛素(mU/L) 24.5 ±1.2b 3.7 ±1.3 11.0 ±1.4 7.9 ±1.4 20.1 ±1.2b 6.7 ±1.3空腹血糖(mmol/L) 5.7 ±0.3b 3.6 ±0.2 4.2 ±0.3 4.0 ±0.3 4.6 ±0.3 4.2 ±0.2睾酮(nmol/L) 4.8 ±0.9b 1.9 ±1.2 4.0 ±1.1b 2.1 ±1.1 4.4 ±1.1b 2.5 ±1.0游离睾酮(pmol/L) 25.1 ±1.1b 7.1 ±1.2 13.2 ±1.1b 4.7 ±0.9 13.2 ±1.0b 5.7 ±1.2性激素结合球蛋白(nmol/L) 227.9 ±16.0a 313.5 ±18.1 417.7 ±28.9a 550.9 ±26.9 440.8 ±21.2a 561.3 ±24.1

3 讨论

近年来，glycodelin与PCOS的发病机制成为研究的热点。glycodelin是一类糖蛋白，最初从胎盘中提取并命名为胎盘蛋白14，但是目前还没有证据证明胎盘能够分泌这种蛋白，因其特有的寡糖结构从而更名为glycodelin。有研究表明，经卵巢甾体激素处理后，glycodelin诱导胚胎种植增强［6］，而当 Glycodelin不表达时，种植几乎完全被阻断，提示glycodelin是植入的一个关键调节蛋白［7］。同时，glycodelin具有免疫抑制作用，胎儿携带来自父方的遗传物质，glycodelin阻止母体把胚胎当作外来抗原进行排斥的调节因子之一［8］。因此，glycodelin在子宫内膜的周期性表达、受精、着床、妊娠和免疫调节等方面发挥着重要的作用。

既往关于PCOS流产的研究多集中在卵巢水平或是针对普通流产患者绒毛与胎儿的生长发育的关系［9-10］。而关于母体外周血及蜕膜组织glycodelin水平与PCOS患者流产的相关研究却很少。本研究发现孕3～8周流产的PCOS患者，其血清glycodelin水平显著低于正常妇女，而孕9～11周流产的PCOS患者血清中glycodelin水平与正常妇女比较差异无统计学意义。结果提示，外周血中低水平的glycodelin可能与PCOS患者流产密切相关，因为glycodelin可以抑制混合淋巴细胞反应和自然杀伤细胞的活性，而当glycodelin水平降低时母体会对胚胎或胎儿产生免疫反应。因此，血清中低浓度glycodelin不利于受精卵着床和维持妊娠的子宫内膜环境。妊娠早期glycodelin是蜕膜组织的主要产物，有研究表明，glycodelin在妊娠最初8周分泌最多，在流产时，glycodelin表达的减少可以激活母体免疫系统，导致对发育中胎儿的排斥［11］。已有研究证实，流产妇女蜕膜组织中glycodelin的表达显著低于正常妊娠妇女［12］。在本实验同时检测了母体蜕膜组织中glycodelin蛋白的表达，结果显示，PCOS患者母体蜕膜组织中glycodelin的表达在不同孕周均显著低于正常妇女。

高胰岛素血症和高雄激素水平是PCOS患者的特征性改变。本研究发现，试验组外周血中孕3～5周和孕9～11周空腹胰岛素水平显著高于对照组，但在妊娠孕6～8周2组比较差异无统计学意义。试验组不同孕周外周血中睾酮水平显著高于对照组，而SHBG水平显著低于对照组，由此带来的综合效应是PCOS流产患者游离睾酮明显高于正常对照组。SHBG主要来源于人体的肝脏，高胰岛素血症、高雄激素以及糖皮质激素均可抑制SHBG的产生［13］。本实验发现在 PCOS患者外周血中SHBG水平显著降低，这可能是高胰岛素血症产生的结果，一方面高胰岛素血症可以直接抑制肝脏生成SHBG，另一方面高胰岛素通过促进皮质醇的产生从而间接抑制SHBG生成。

综上所述，在孕3～8周中PCOS患者血清中glycodelin水平显著降低，妊娠前3个月中PCOS患者蜕膜组织中glycodelin水平显著降低，提示PCOS患者早期流产与子宫内膜上皮及间质功能障碍密切相关，胰岛素抵抗可能是流产发生的关键环节，而高雄激素可能通过胰岛素抵抗这一中间环节对PCOS患者流产产生影响。本实验的研究结果为进一步探究PCOS患者的流产机制提供了一定的理论基础，血清glycodelin可能用于鉴定妇女流产的危险因素。在妊娠期间，增加血清glycodelin浓度，可能被证实有助于预防正常妇女与PCOS患者的流产，以及其他类型的高胰岛素血症不孕。

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