肝纤维化大鼠血清及肝组织基质金属蛋白酶-1及其抑制因子表达的变化

罗国彪 舒建昌

暨南大学医学院附属广州市红十字会医院消化内科，广东广州 510220

肝纤维化是由于各种致病因子引起肝脏的损伤和炎症，导致纤维组织广泛增生和沉积，其发生、发展过程与细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的沉积与降解相对失衡有关，而ECM的变化和组织基质金属蛋白酶-1（MMP-1）及基质金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）表达有密切的关系，本研究通过动物实验方法，结合既往实验基础上[1]，采用酶联免疫吸附测定法、免疫组化染色法分别检测正常及肝纤维化大鼠血清及肝组织MMP-1及TIMP-1表达的变化，分析两者在肝纤维化中的作用，以期为肝纤维化预防提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选择 2011年11月～2013年 11月，SPF级SD大鼠20只，体质量180～200 g，雄性，购自南方医科大学动物实验中心[SCXK（粤）200620015粤监证字2006B2008]。于广东省药物研究所标准SPF级动物实验室 （合格证号：2006C125号）进行动物饲养及实验。

1.1.2 试剂 大鼠MMP-1及大鼠TIMP-1定量检测试剂盒（ELISA）（上海西唐生物科技有限公司），大鼠抗MMP-1及大鼠TIMP-1单克隆抗体 （武汉博士德生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 肝纤维化模型建立：根据前期实验[2]及相关文献建模[1-3]。

1.2.2 实验分组及处理 20只雄性SD大鼠适应饲养1周后，随机分为2组，正常组10只大鼠，不作其他处理，常规饲养12周；模型组10只大鼠，腹腔注射CCl40.025 mL（用花生油1∶6稀释），每周3次，动物实验共12周。动物实验结束后，采用摘眼球采血法最大量取血，并置于未加抗凝剂的普通干净玻璃试管中。剖开大鼠腹腔暴露肝脏，留取肝脏左叶，留取部分肝组织于4%中性福尔马林液固定，置于包埋盒中，于切片机切片，厚度3 μm，裱片于普通载玻片上进行免疫组化染色。

1.2.3 指标检测 按照试剂盒说明书以ELISA方法检测血清MMP-1和TIMP-1含量；免疫组化染色检测肝组织MMP-1和TIMP-1表达，组织中出现棕色或黄色的部位为阳性表达部位，在高倍镜（400×）下，每张切片随机选择10个视野，采用专业显微彩色图像分析软件计算每个视野下阳性部位面积的百分比，取其均值为该张切片的阳性表达面积，再进行统计学处理。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 12.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（±s）表示，两独立样本的计量资料采用t检验；计数资料以率表示，采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清MMP-1及TIMP-1含量比较

模型组大鼠血清中MMP-1含量较正常组明显降低，差异有高度统计学意义 （t=13.38，P<0.01），血清中TIMP-1含量升高明显，差异有高度统计学意义（t=31.92，P<0.01）。见表1。

表1 血清MMP-1及TIMP-1含量比较（±s）

表1 血清MMP-1及TIMP-1含量比较（±s）

注：与正常组比较，▲P<0.01；MMP-1：基质金属蛋白酶-1；TIMP-1：基质金属蛋白酶组织抑制因子-1

553.81±98.89 113.49±18.95▲13.38<0.01 10.17±1.35 25.84±0.76▲31.92<0.01 MMP-1（μg/L） TIMP-1（μg/L）正常组模型组t 值P 10 10组别 只数

2.2 肝组织MMP-1及TIMP-1阳性百分比分析

MMP-1 模型组阳性表达面积比例[（5.60±1.51）%]与正常组比较明显下降，差异有高度统计学意义（t=14.37，P<0.01）。TIMP-1阳性百分比分析，模型组阳性表达面积与正常组比较明显升高，差异有高度统计学意义（t=38.96，P<0.01）。见表2。

3 讨论

肝纤维化的发生是一过复杂的过程，往往会带来肝硬化甚至肝癌等不良的后果，积极探索肝纤维化发病机制，寻求有效治疗措施对降低肝硬化发病率具有重要意义。肝纤维化发生的原因较多，一般是ECM的生成与沉积增加，造成ECM积累，最后导致肝纤维化。肝纤维化的形成过程主要取决于胶原的合成、沉积、降解、吸收的动态平衡，其消退的特征是肝纤维化基质的降解和正常肝组织的恢复，其发生、发展过程与ECM，特别是胶原的沉积与降解相对失衡有关，这种过度沉积不仅是由于ECM合成增多，更大程度上是由于降解减少引起[4-5]，提示促进ECM各成分的降解是抗肝纤维化的重要途径，影响ECM降解的主要是MMPS和TIMPS，而ECM主要是Ⅰ、Ⅲ型胶原的沉积。目前在肝内共发现了8种基质金属蛋白酶，其中MMP-1能够降解纤维化中肝脏中ECM的主要成分Ⅰ、Ⅲ型胶原[6]，TIMP-1增加和（或）MMP-1减少，可使ECM降解减少，特别是胶原降解减慢，导致组织纤维化发生，反之，导致ECM发生破坏性重建[7]。TIMP-1是体内MMP-1的特异性抑制剂，它能通过其N-末端特异性地与MMP-1催化活性中心的锌离子结合，从而封闭其催化活性，使有活性的MMP-1失活[8]，TIMP-1是抑制MMP活性的一组多功能因子家族的主要成员之一，是一种分子质量单位约为28.5 kd的糖蛋白，在肝脏中由枯否细胞、肝星状细胞及肌纤维母细胞产生。活化的肝星状细胞表达TIMP-1最强，TIMP-1主要抑制MMP-1活性[9]，TIMP-1主要由激活的肝星状细胞、肝细胞、内皮细胞分泌，主要作用是抑制胶原酶的活性，同时抑制基质分解素和明胶B，在肝纤维化时其表达明显增加，主要由位于肝中央静脉、汇管区周围及肝窦壁的间质细胞分泌[10]，因而TIMP-1在肝组织中的表达水平可以反映肝组织学纤维化程度[11-12]。前期研究显示，经复方中药干预的大鼠肝组织中的Ⅰ、Ⅲ型胶原含量明显降低，造模组MMP-1表达降低、TIMP-1表达升高，复方中药组MMP-1表达明显升高，与造模组相比，正常组及复方中药组MMP-1表达显著升高，TIMP-1表达明显降低[13-16]，与本实验结果相一致。本研究结果显示，血清及肝组织MMP-1及TIMP-1与肝纤维化关系密切，史玉岭[17]使用ROC曲线评估TIMP-1诊断肝纤维化的敏感度、特异性，明显高于肝纤维化标记物HA、PCⅢ、CⅣ、LN，提示血清 TIMP-1诊断肝纤维化有较高的敏感度和特异性，其水平可反映肝纤维化的程度。

表2 各组大鼠肝组织MMP-1及TIMP-1免疫组化图像分析面积百分比（%，±s）

表2 各组大鼠肝组织MMP-1及TIMP-1免疫组化图像分析面积百分比（%，±s）

注：与正常组比较，▲P<0.01；MMP-1：基质金属蛋白酶-1；TIMP-1：基质金属蛋白酶组织抑制因子-1

19.20±1.48 5.60±1.51▲14.37<0.01 3.22±0.70 17.10±0.84▲38.96<0.01 MMP-1 TIMP-1正常组模型组t 值P 10 10组别 只数

本研究为肝纤维化判断指标提供实验佐证并为临床上寻找治疗肝纤维化药物打下了实验基础，而如何调节MMP-1及TIMP-1两者的平衡，抑制TIMP-1的表达将为防治肝纤维化提供新的研究方向。

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