1，3-二苯-1，3-丙二酮对环磷酰胺诱导骨髓微核的预防保护作用

刘晓晓 贾凤兰 阮 明 张宝旭

北京大学公共卫生学院毒理学系 国家中医药管理局中药配伍减毒重点研究室，北京 100191

1，3-二苯-1，3-丙二酮 （1，3-diphenyl-1，3-proanedione，DPPD），是存在于甘草根中的一种 β-二酮类物质[1]，研究发现其具有化学防癌[2-4]、抑制DNA及蛋白质损伤、抗氧化[5]、抗炎症等多方面的功效。本实验室对其多年的研究发现，DPPD能够拮抗四氯化碳、可卡因、N-甲基甲酰胺等化学物质造成的肝脏损伤[5-7]。在以往研究的基础上，本研究对其遗传毒性进行评价，并探讨DPPD对环磷酰胺诱导骨髓细胞微核形成有无预防保护作用，提供DPPD临床应用的依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

ICR雄性小鼠，体重16～18 g，由北京大学医学部实验动物科学部提供，生产许可证号：SCXK（京）2011-0012，使用许可证号：SYXK（京）2011-0039。在恒温（21～23℃）、恒湿（45%～65%）、12 h明暗周期交替的动物饲养室，实验前小鼠先适应3 d，自由进食和饮水。

1.2 试剂

DPPD（批号：S26175 005），购自 MERCK-Schuchardt，用1%（V/V）吐温-80水溶液配置成混悬液；环磷酰胺（批号：09121721），江苏恒瑞医院股份有限公司，用生理盐水溶解；甲醇（分析纯，批号：20100607），北京益利精细化学品有限公司；小牛血清，上海拜力生物科技有限公司。

1.3 仪器

AR2130/C型电子天平（210 g/0.001 g，美国OHAUS公司）；OLYMPUS 显微镜。

1.4 方法

40只小鼠随机分为8组，分别为阴性对照组，环磷酰胺阳性对照组，环磷酰胺+DPPD低、中、高剂量组（62.5、250、1000 mg/kg），DPPD 低、中、高剂量组（62.5、250、1000 mg/kg），每组各5只。环磷酰胺+DPPD剂量组和DPPD剂量组经口给予DPPD 30 d，每天1次，给药体积0.2 mL/10g。阴性对照组每天给予相同体积的1%（V/V）吐温-80水溶液。环磷酰胺采用30 h两次经口给药法，给药剂量40 mg/kg，给药体积0.1 mL/10g，小鼠给药第29天，环磷酰胺阳性组和环磷酰胺+DPPD剂量组经口给予环磷酰胺，间隔24 h后，第2次经口给予环磷酰胺，第2次给药6 h后，小鼠麻醉后颈椎脱臼处死。立即取股骨制备骨髓涂片，涂片自然干燥后用甲醇固定，经Giemsa染色，蒸馏水冲洗、晾干。采用双盲法阅片，每只小鼠计数1000个嗜多染红细胞，观察含有微核数的嗜多染红细胞数，以千分率表示微核数，并计算抑制率，抑制率计算方法：抑制率（%）=（致突变物对照组微核率-受试样品组微核率）/（致突变物对照组微核率-空白对照组微核率）×100%。

1.5 统计学方法

采用统计软件SPSS 13.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，采用方差分析，比较t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DPPD对骨髓微核形成的影响

与阴性对照组相比，DPPD组小鼠经口给予DPPD 30 d，DPPD各剂量组微核率变化不明显，差异无统计学意义（P＞0.05），由此可以看出DPPD本身不具有遗传毒性，见表1。

表1 DPPD对骨髓细胞微核形成的影响

2.2 环磷酰胺对骨髓细胞微核形成的影响

与阴性对照组相比，环磷酰胺30 h经口给药后，环磷酰胺阳性组小鼠微核率明显升高，差异具有高度统计学意义（P＜0.01），表明环磷酰胺造模成功。见表2。

表2 环磷酰胺对骨髓细胞微核形成的影响

2.3 DPPD对环磷酰胺诱导骨髓细胞微核的影响

结果所示，与环磷酰胺阳性组相比，环磷酰胺+DPPD低剂组小鼠微核率变化不明显，差异无统计学意义（P＞0.05）；环磷酰胺+DPPD中、高剂量组小鼠微核率明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）；其微核抑制率分别为35.58%和61.54%。随着DPPD剂量的升高，微核率逐渐下降，并呈现一定的剂量反应关系。见表3。

表3 DPPD对环磷酰胺诱导骨髓细胞微核形成的影响

3 讨论

目前，微核试验是一种应用广泛的遗传毒性检测方法之一，是反映染色体损伤的一种简易、快速的方法。很多国家和国际组织将微核实验规定为评价新药和食品添加剂等化合物安全性毒理学评价的必做试验之一[8]。它主要是通过微核率的变化情况反映化学物质的遗传毒性，因此微核率是检测细胞遗传毒性损伤的一项重要指标。

有文献报道，长期喂养DPPD（1%饲料含量）未观察到实验动物的毒性体征[9]。本实验室通过DPPD急性经口毒性试验，发现DPPD小鼠经口灌胃的LD50＞17.5 g/kg，可以认为是低毒或无毒物质。

本次试验结果显示，通过比较DPPD组和阴性组发现长期灌胃给予DPPD并未使骨髓细胞微核形成率升高；通过比较环磷酰胺+DPPD组与环磷酰胺阳性组发现DPPD对环磷酰胺诱导骨髓细胞微核形成具有一定的预防保护作用，能够明显抑制环磷酰胺诱导的骨髓细胞微核形成，且随着DPPD剂量的增加，抑制作用增强，此结果提示DPPD不具有遗传毒性，并且可以拮抗环磷酰胺诱导骨髓细胞微核的形成。环磷酰胺常用于抗肿瘤[10]治疗，同时环磷酰胺具有免疫抑制作用，并用于自身免疫性疾病的治疗[11-14]，其疗效显著，应用广泛。但是环磷酰胺常常引起骨髓抑制不良反应，使其应用受限。而DPPD本身可以应用于化学防癌[2-4]，如果将DPPD与环磷酰胺联合使用，不但可以拮抗环磷酰胺的毒副作用，而且可以提高其抗癌疗效。因此，本研究将在此基础上进一步研究DPPD作用机制，并研究与其他药物联合使用的效果，为临床应用提供科学依据。

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