人表皮生长因子受体显性负性突变体诱导胃癌细胞发生G0/G1期阻滞*

廖 刚， 王子卫△， 张 能， 董浦江， 汤为学

(重庆医科大学1附属第一医院胃肠外科，3附属第一医院实验研究中心，4基础医学院病理生理学教研室，重庆400016;2云南省第一人民医院普通外科，云南昆明650032)

人表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)为酪氨酸蛋白激酶型受体，由胞外区、跨膜区和胞内区三部分构成，与配体结合后，相互之间形成同源二聚体，也可与其它的酪氨酸激酶受体形成异源二聚体，导致胞内区的酪氨酸激酶区的激活，最终引起一系列相关基因活化，在肿瘤发生发展中扮演着重要角色［1-3］。缺失胞内区的EGFR为其显性负性突变体(dominant negative EGFR，DNEGFR)，可以阻断EGFR信号通路。肿瘤是一类细胞周期相关疾病，胃癌也不例外。针对肿瘤细胞周期进行调控，近年来一直是肿瘤生物治疗的重要研究方向。DNEGFR是否对人胃癌细胞的周期有调控作用?以及具体分子机制是什么?目前未见相关报道。

材料和方法

1 细胞

人胃癌细胞株SGC-7901及NCI-N87购自中国科学院细胞库。pEGFP-N1质粒稳定转染的SGC-7901及NCI-N87细胞，稳定表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP);pEGFPN1-DNEGFR质粒稳定转染的SGC-7901及NCIN87细胞，稳定表达DNEGFR;均由我们前期实验筛选成功保存［4］。

2 主要试剂、耗材及仪器

PBS磷酸盐缓冲液(0.01 mol/L，pH 7.2 ～7.4)购自北京中杉金桥生物技术有限公司。无水乙醇购自重庆川东化工(集团)有限公司。PI购自Sigma-Aldrich。RPMI-1640培养基粉末、胰酶和G418购自Invitrogen。Ser9位点磷酸化糖原合成激酶3β［phosphorylated glycogen synthase kinase 3 beta at Ser9，p-GSK-3β(Ser9)］兔单克隆抗体购自 Cell Signaling Technology。GAPDH(FL-335)抗体、p21(C-19)抗体、cyclin D1(A-12)抗体、周期素依赖性蛋白激酶2(cyclin dependent kinase 2，CDK2)(H-298)抗体和p27(C-19)抗体购自Santa Cruz。BCA protein assay kit、Pierce ECL Western blotting substrate 和 stripping buffer购自 Thermo Fisher Scientific。RIPA裂解液(强)、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、PMSF(100 mmol/L)、彩色预染蛋白质分子量标准和DS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)购自江苏省碧云天生物技术研究所。PVDF膜购自Bio-Rad。

Forma 310系列直热式 CO2培养箱为Thermo Fisher Scientific产品。SW-CJ系列医用型洁净工作台为苏州安泰空气技术有限公司产品。Gel Doc XR凝胶成像系统、电泳仪和680型全自动酶标仪为Bio-Rad产品。流式细胞仪为BD Biosciences产品。

3 方法

3.1 实验分组 实验分为如下6组:(1)SGC-7901细胞空白对照组(即SGC-7901细胞未转染组，US组);(2)SGC-7901细胞pEGFP-N1质粒转染组(ES组);(3)SGC-7901细胞pEGFPN1-DNEGFR质粒转染组(DS组);(4)NCI-N87细胞空白对照组(即NCI-N87细胞未转染组，UN组);(5)NCI-N87细胞pEGFP-N1质粒转染组(EN组);(6)NCI-N87细胞pEGFPN1-DNEGFR质粒转染组(DN组)。

3.2 细胞培养 未转染细胞常规培养于含10%的胎牛血清的RPMI-1640培养液，在37℃、5%CO2及相应湿度条件的CO2孵箱中培养，定期观察细胞生长情况，在对数生长期用0.25%的胰酶消化，进行传代培养。转染的 SGC-7901细胞，采用 150 mg/L G418终浓度的完全培养基维持培养;转染的NCIN87细胞，采用250 mg/L G418终浓度的完全培养基维持培养。

3.3 细胞周期检测 细胞周期检测根据文献［5-6］操作并作一些改进。取无菌Eppendorf管，预装1 mL 70%乙醇，放入4℃冰箱预冷。用胰酶分别消化收获处于对数生长期的6组单层胃癌细胞，1 000 r/min离心5 min弃上清，用预冷PBS洗细胞3次。第3次洗细胞离心弃PBS时，不要完全吸弃PBS，待附在离心管壁的PBS回流到管底后，用微量移液器轻轻吹打使离心到管底的细胞成细胞悬液。将细胞悬液加入预冷的70%乙醇，4℃固定过夜。1 000 r/min离心5 min弃70% 乙醇，PBS洗细胞3次。加入0.5 mL PI染液重悬细胞，并放在37℃水浴中孵育30 min。设定流式细胞仪参数，进行细胞周期检测。细胞周期分布采用Modifit-3软件(Verity Software House)计算每组细胞重复实验3次。

3.4 Western blotting检测 Western blotting实验方法主要根据文献［7］并作以下改进，cyclin D1和p27抗体稀释比例为1∶100，CDK2、p21和 GAPDH抗体稀释比例为1∶200，p-GSK-3β(Ser9)抗体稀释比例为1∶1 200，使用Gel Doc XR凝胶成像系统采集图像。目的蛋白相对表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参照蛋白条带灰度值，实验重复3次。

4 统计学处理

数据以均数±标准差(mean±SD)表示。组间差异比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，如果差异有统计学意义则进一步采用LSD-t检验进行两两比较，应用SPSS 17.0 for Windows软件处理，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 细胞生长情况

各组人胃癌细胞生长状态均良好，但是生长速度有一定差异。相对于US组及ES组，DS组细胞生长速度明显要慢些。同样，相对于UN组及EN组，DN组细胞生长速度明显要慢些。

2 DNEGFR导致G0/G1期阻滞

对于SGC-7901细胞，US组及ES组G0/G1期分别为(50.03±2.01)%和(49.61±0.49)%，二者没有显著差异，DS组则上升到(70.88±0.85)%(P＜0.05);US组及ES组S期分别为(43.63±1.26)%和(43.63±0.64)%，二者没有显著差异，DS组则降低到(21.58±1.40)%(P＜0.05)。对于NCI-N87细胞，UN组及 EN组 G0/G1期分别为(47.90±2.52)%和(48.79±4.12)%，二者没有显著差异，DN组则上升到(69.27±4.52)%(P＜0.05);UN组及EN组S期分别为(41.77±3.08)%和(42.76±3.38)%，二者没有显著差异，DN组则降低到(21.88±2.40)%(P＜0.05)。另外，在DS及DN组中，流式细胞周期测定图中G0/G1期峰前出现了亚二倍体峰，表明DNEGFR-EGFP还能够诱导胃癌细胞凋亡，见图1。

Figure 1.Cell cycle assay of gastric cancer cells.Mean ±SD.n=3.*P ＜0.05 vs US or ES;#P ＜0.05 vs UN or EN.图1 胃癌细胞周期分析

3 DNEGFR对细胞周期相关蛋白水平的调控作用

US组及ES组SGC-7901细胞活性CDK2、cyclin D1、p-GSK-3β(Ser9)、p21 和 p27 蛋白水平没有显著差异;与US组及ES组比较，DS组CDK2、cyclin D1和 p-GSK-3β(Ser9)蛋白水平降低(P ＜0.05)，p21、p27蛋白水平则升高(P＜0.05)。UN组及 EN组NCI-N87 细 胞 活 性 CDK2、cyclin D1、p-GSK-3β(Ser9)、p21和p27蛋白水平没有显著差异;与UN组及EN组比较，DN组CDK2、cyclin D1和pGSK-3β(Ser9)蛋白水平降低(P ＜0.05)，p21、p27 蛋白水平则升高(P ＜0.05)，见图2。

Figure 2.Expression of the proteins relative to cell cycle detected by Western blotting.Mean ±SD.n=3.*P ＜0.05 vs US or ES;#P＜0.05 vs UN or EN.图2 Western blotting检测细胞周期相关蛋白的表达

讨 论

细胞周期(cell cycle)是指一个连续分裂的细胞从一次分裂完成开始，直到下一次分裂完成为止经历的全过程［8］。细胞周期包括4个时相:G1期、S期、G2期和M期。G1期为DNA合成前期，主要合成RNA和蛋白质，其是DNA复制所必需的，影响着S期的正常启动;S期为DNA合成期;G2期为DNA合成后期，主要进行有丝分裂中新细胞形成所必需物质的合成，是决定细胞能否顺利进入M期(有丝分裂期)的关键。在哺乳动物细胞G1期存在特定的时点，Pardee［9］命名此点为限制点(restriction point)，在限制点之前如果细胞缺乏外界生长信号的持续刺激，则其会终止分裂周期进入休眠状态，称为G0期。在G0期，细胞可长期存活而不分裂增殖，当受到生长信号刺激，即可从G0期返回G1期继续生长分裂进程，而且即使在G1中晚期通过限制点后再除去外界生长信号的刺激，也不会阻止细胞进入S期。

细胞通过G1中晚期限制点后，细胞周期开始运行，一套严格的质量监控机制开始运作，它就是细胞周期的检查点(check point)机制。检查点由Weinert等［10］和 Hartwell等［11］首先发现并描述，实质上是细胞在长期进化过程中发展出的一系列存活机制，作为在基因组或纺锤体损伤，或细胞周期某一事件不能按时完成情况下的一种补救措施，在G1/S交界点存在DNA损伤检查点［12］。Cyclin D1是一重要的细胞周期调控分子［13］，不仅是调控细胞通过G1期限制点(即G0/G1期转换)的关键分子之一，而且是G1/S转换的关键分子，cyclin D1-CDK4/6可使pRb处于磷酸化状态而灭活［14］，释放出其扣留的大量转录因子，尤其是E2F，启动细胞周期进入S期所需蛋白的转录。另外，cyclin E-CDK2也能够使pRb处于磷酸化状态而灭活［15-17］。Cyclin D1-CDK4/6在 G1期早期即开始发挥作用导致pRb磷酸化 ，而cyclin E-CDK2直到G1晚期才开始发挥作用，cyclin D1-CDK4/6发挥作用导致pRb部分磷酸化是cyclin ECDK2发挥作用的基础［16-17］。p21和p27是重要的CDK 抑制蛋白，p21 能够抑制 CDK2 和 CDK4［18］，p27则能够抑制 CDK4、CDK6 或者 CDK2［19］。

在本实验中，人胃癌细胞被pEGFPN1-DNEGFR转染后，将表达DNEGFR-EGFP融合蛋白，EGFP作用在于其便于对DNEGFR进行定位，对DNEGFR功能无影响;DNEGFR降低内源性EGFR Ser1046位点磷酸化水平，进而降低内源性EGFR功能，具有显性负调控作用［20］。我们采用pEGFPN1-DNEGFR转染人胃癌细胞，通过表达DNEGFR来阻断人胃癌细胞EGFR信号转导通路，探讨其对人胃癌细胞周期的影响及分子机制。

我们采用流式细胞术进行细胞周期检测，结果提示DS及DN组胃癌细胞G0/G1期比例均升高，而S期比例均下降，表明DNEGFR能够导致胃癌细胞G0/G1期阻滞，与采用EGFR单克隆抗体西妥昔单抗(cetuximab)在鳞状细胞癌细胞中的研究结果基本一致［21］。那么，DNEGFR能够导致胃癌细胞G0/G1期阻滞是否与CDK2、cyclin D1、p21和p27相关呢?如果有关，具体调控机制又是什么呢?

为了明确胃癌细胞G0/G1期阻滞的分子机制，我们采用Western blotting检测 CDK2、cyclin D1、p21、p27和p-GSK-3β(Ser9)蛋白水平。检测结果提示DS及DN组胃癌细胞CDK2、cyclin D1和p-GSK-3β(Ser9)蛋白水平降低，而p21和p27蛋白水平则升高。对于GSK-3β，Ser9位点磷酸化后处于其非活性状态［22］。据此，我们推论，pEGFPN1-DNEGFR 转染胃癌细胞后，表达出DNEGFR蛋白，DNEGFR与内源性EGFR竞争结合EGF，导致EGF缺乏(EGF withdrawal)，通过降低Ser9位点磷酸化水平激活GSK-3β使cyclin D1蛋白水平降低，cyclin D1-CDK4/6含量减少;DNEGFR还使CDK2蛋白水平降低，cyclin E-CDK2含量减少;同时，DNEGFR上调p21、p27蛋白水平，抑制cyclin D1-CDK4/6及cyclin E-CDK2活性;以上三方面因素共同参与使pRb处于低磷酸化状态，导致大量转录因子尤其是E2F被扣留，最终使胃癌细胞发生G0/G1期阻滞。

综上所述，我们发现DNEGFR能够诱导胃癌细胞发生G0/G1期阻滞，并明确了部分分子机制，将为胃癌生物治疗研究提供新思路。然而，细胞周期的调控环节极为复杂，参与其中的蛋白非常多。是否有其它因素参与胃癌细胞的G0/G1期阻滞呢?这有待我们的进一步研究来明确。

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