超高效液相色谱－串联四级杆质谱法检测镇静安神类中药制剂及保健品中非法添加的9种化学药品

田 兰，张继春，陈 睿，储忠英，包综方

(上海市松江食品药品检验所，上海 201600)

目前，失眠的人群越来越多，有一部分人不得不借助镇静安神类药物维持正常的睡眠和生活。多数人认为中药和保健品作用较缓和、不良反应小，更喜欢使用中药制剂和保健品，但个别不法商家为牟取暴利，在中药制剂及保健品中非法添加镇静催眠类化学药，以增强药效，这不仅使中成药原有的药效可能发生改变，同时也使患者的用药安全得不到应有的保障[1]。此类药物也不可避免地存在某些副作用，如出现困倦、嗜睡、乏力、头晕，大剂量使用时可引起共济失调、暂时性的遗忘和意识障碍，严重时还可能导致昏迷、呼吸抑制。此外，安眠药还具有易产生耐受性和依赖性的特点[2]。况且，该类药物的半衰期很长，达50 h。本试验中选择了氯硝西泮、氯氮、艾司唑仑、阿普唑仑、地西泮、硝西泮、三唑仑、奥沙西泮和马来酸咪达唑仑9种易被非法添加的药物为检测对象。目前根据国家食品药品监督管理局药品检验补充检验方法和检验项目批准件汇编有关规定测定这9种化学药物的方法有薄层色谱法、高效液相色谱－串联四级杆质谱(HPLC－MS/MS)法分别测定[3]。笔者建立了同时测定非法添加9种化学药品的超高效液相色谱－串联四级杆质谱(UPLC－MS/MS)法，为强有力打击制假售假违法者提供技术保障和科学依据。

1 仪器与试药

Waters ACQUITY UPLC Quattro MicroTM超高效液相色谱串联三重四级杆质谱联用仪，MassLynx4.1质谱工作站。对照品氯硝西泮(批号为 171227－200302)、氯氮(批号为 171248－200301)、艾司唑仑(批号为 1219－0102)、阿普唑仑(批号为 171218－200603)、地西泮(批号为 171225－200302)、硝西泮(批号为171217－200402)、三唑仑(批号为 1230－9701)、奥沙西泮(批号为 171229－200603)和马来酸咪达唑仑(批号为 171250－201002，含量为99.9%)均由中国药品生物制品检定所提供;样品由药监分局监督抽验;甲醇为色谱纯(购自Merk公司)，甲酸选用进口色谱纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 检测条件

色谱条件:Acquity UPLC超高效液相色谱系统，Acquity BEH C18柱(2.1 mm × 50 mm，1.7 μm);流动相 A 为甲醇，流动相B为0.1%甲酸溶液，按表1进行梯度洗脱;流速0.3 mL/min，进样量 5 μL，柱温为 35 ℃。

表1 流动相梯度洗脱表

质谱条件:Quattro MicroTM三重四级杆质谱，离子化模式为ESI+，检测方式为多反应监测(MRM);毛细管电压3 kV;脱溶剂气温度350℃，脱溶剂气流量600 L/h;锥孔反吹气30 L/h。锥孔电压和碰撞能量见表2。

表2 质谱参数

2.2 质谱分析及定性、定量

以电喷雾离子化方式对9种药物的标准溶液进行MS扫描，9种化合物均形成[M+H]+准分子离子峰，以此作为母离子，进行碎片扫描，选择丰度较强的2个子离子。经试验，9种化合物均在正离子检测方式下具有较高的灵敏度，因此采用正离子检测的方式进行UPLC－MS/MS分析。定性鉴别时，以化合物的保留时间及2组离子对进行确认。定量测定时以定量离子对的响应做外标法进行定量分析。9种化合物的总离子流图(TIC)见图1，二级质谱图见图2。

图1 9种化合物的总离子流图

2.3 溶液制备

混合标准贮备液:精密称取经60℃减压干燥的9种药物的对照品适量，用甲醇溶解并制成每mL含有50 μg的标准贮备液并保存于冰箱中。

供试品溶液:对于片剂，取10片，研细;对于胶囊剂，取10粒胶囊，将内容物取出，必要时研磨，将胶囊壳剪碎，与内容物混匀;对于蜜丸，将蜜丸粉碎成细小颗粒;对于颗粒剂，取5袋，研细。称取处理好的样品的一次口服用量，精密称定，置100 mL量瓶中，加甲醇约70 mL，超声提取20 min，放冷至室温，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，经过夜沉淀后取上层溶液适量，高速离心(不小于105/min)，取上清液用流动相溶液稀释10～100倍，即可。

2.4 方法学考察

线性关系考察:分别精密吸取2.3项下标准贮备液适量，用甲醇稀释成 25，50，100，250，500，600，800，1 000 μg/L 的混合标准系列浓度溶液，进行UPLC－MS/MS测定。以化合物定量离子对的峰面积(Y)对相应的质量浓度(X)进行线性回归，见表3。

图2 9种化合物的二级质谱图

表3 9种化合物线性关系

重复性试验:精密称取阳性样品平行6份，每份1次口服用量，照2.3项下方法制得供试品溶液，进样5 μL。结果检出地西泮，其余均未检出(图3)。根据地西泮的定量离子峰面积，计算地西泮的平均含量为 0.521 82 mg/g，RSD 为 1.2%(n=6)。

精密度试验:取300 μg/L加标水平混合标准溶液，在拟订的UPLC－MS/MS条件下连续测定6次，由氯硝西泮、氯氮、艾司唑仑、阿普唑仑、地西泮、硝西泮、三唑仑、奥沙西泮和马来酸咪达唑仑定量离子对峰面积计算精密度，RSD分别为4.9%，1.3%，1.8% ，3.6%，2.1%，2.6% ，6.6%，1.3% ，1.5%(n=6)。

检测限和定量限:取混合对照品贮备液，用甲醇稀释成一定质量浓度的溶液后测定各化合物的信噪比，依据检出限为3倍信噪比(S/N=3)，定量限为10倍信噪比(S/N=10)，分别得出各化合物的检测限:氯硝西泮1×10－3ng、氯氮0.2 ×10－3ng、艾司唑仑 0.2 ×10－3ng、阿普唑仑 0.3 ×10－3g、地西泮 1.5 ×10－3ng、硝西泮 0.3×10－3ng、三唑仑 1.2 ×10－3ng、奥沙西泮 0.2×10－3ng 和马来酸咪达唑仑 0.2 ×10－3ng。定量限:氯硝西泮 3 ×10－3ng、氯氮卓 0.7 ×10－3ng、艾司唑仑 0.6 ×10－3ng、阿普唑仑 1 ×10－3g、地西泮 5×10－3ng、硝西泮 1×10－3ng、三唑仑 4×10－3ng、奥沙西泮0.6×10－3ng和马来酸咪达唑仑 0.6 ×10－3ng。

稳定性试验:取300 μg/L加标水平混合标准溶液，分别在配制后于室温下放置 0，3，6，12，18，24 h 时测定，根据地西泮、氯硝西泮和艾司唑仑定量离子对峰面积计算精密度，RSD分别为5.1% ，1.5% ，2.0% ，3.9% ，2.2% ，2.9% ，6.6% ，1.8% ，1.7%(n=6)。结果表明，9种化合物在24 h内基本稳定。

图3 样品的多反应监测图

加样回收试验:精密称取阴性样品9份，分别精密加入混合标准储备液适量，照2.3方法提取，终质量浓度分别为200，300，500 μg/L，每个质量浓度水平平行试验3份，根据外标法计算9种化合物的平均回收率。结果见表4。

专属性试验:分别取约3 g空白制剂的粉末和添加了检测限浓度的9种镇静催眠药的相同制剂粉末，按照2.3项下方法制备。所得到的定量离子对多反应监测色谱图表明，在9种镇静催眠药的出峰位置，空白样品中无干扰峰出现，该方法具有较好的专属性。

2.5 样品检测

样品按2.5项下方法制备，在拟订的UPLC－MS/MS条件下测定，结果11批抽验样品其中2批检出地西泮，其余均无非法添加。

3 讨论

由于中药成分的复杂性，故有必要采用高选择性的分析手段。本法可快速、准确地对中药制剂及保健品中非法添加氯硝西泮、氯氮、艾司唑仑、阿普唑仑、地西泮、硝西泮、三唑仑、奥沙西泮和马来酸咪达唑仑同时进行检测，专属性强，9种化合物可达基线分离，分离速度快。

本法建立了镇静安神类中成药及保健品中非法添加9种化合物的专属检测方法。试验考察了乙腈－水和甲醇－水体系为流动相对目标化合物的分离效果，结果表明，这两种体系为流动相时，目标化合物的质谱信号响应存在差别，甲醇－水体系灵敏度高且噪音小，且安全和经济性较乙腈－水好，综合考虑选择甲醇－水体系为流动相。在建立方法时分别采用等度洗脱和梯度洗脱的方法进行比较，结果梯度洗脱分离速度明显比等度洗脱快且分离效果好，因此采用0.1%甲酸－甲醇梯度洗脱。

ESI(+)模式下，常采用加入挥发性酸以降低流动相的pH，有助于待测药物的离子化。在ESI中，流速大意味着同时进入离子源的化合物也增多。需要同时离子化的化合物增多，加剧了待测成分与基质成分在电离过程的竞争，从而使待测成分的响应降低。此外，在低流速下可产生较细的雾滴，而使雾滴的总表面积增加，待测成分与基质成分在表面积的竞争减少，从而有利于产生气相离子，提高待测成分的信号强度。该试验中选择流速为0.3 mL/min，既避免了待测成分因出峰过快而易受杂质峰的干扰，同时又最大程度地缩短了分析时间，满足了实际应用中复杂中药样品的测定。

表4 9种化合物的回收率(n=9)

[1]李欣荣，陈安珍，杨 钊.UPLC－MS/MS检测消肿止痛类中成药中违禁添加的双氯芬酸钠和氨基比林[J].药物分析杂志，2010，30(7):1 294.

[2]Peng Z，Sharon SY，Peiling H，et al.Simultaneous determination of synthetic phosphodiesterase－5 inhibitors found in a dietary supplement and pre mixed bulk powders for dietary supplements using high－performance liquid chromatography with diode array detection and liquid chromatography－electrosp ray ionization tandem mass spectrometry[J].J Chromatogr A，2006，1 104:113 －122.