顶空气相色谱法快速测定全血中乙醇与甲醇的含量

赵东玲，王粉安，郑海波，马丽霞

(1.西安交通大学医院，陕西 西安 710061;2.瑞鑫药业有限公司，陕西 西安 710061;3.西安交通大学医学院法医系，陕西 西安 710061)

在打击假酒和非法勾兑酒案件、酒后驾车事故责任鉴定及临床上甲醇和乙醇中毒的诊断治疗等方面，都需要测定相关事件当事人血液甲醇与乙醇的质量浓度作为判断指标和证据。甲醇与乙醇的检测方法有多种[1－5]，如化学法、醇脱氢酶法、气相色谱法等，但关于全血中甲醇与乙醇同步检测的报道很少。笔者建立了检测全血中甲醇与乙醇的快速顶空气相色谱法(HS－GC)，以外标法定量，结果可靠，操作简便。现报道如下。

1 仪器与试药

岛津GC－2014C型气相色谱系统及其工作站;DK－3001A型顶空进样器(北京中兴分析仪器新技术研究所);TB－215D型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。乙醇、甲醇均为色谱纯试剂;分析用水均为双蒸水，本实验室自制。

2 方法和结果

2.1 色谱条件

色谱柱:AT－PEG－20M 毛细管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm);进样口温度:200℃;柱温:40℃;载气:高纯氮气;检测器:FID;温度:250℃;分流比:20∶1;检测时间6 min;加热箱温度70℃;传输线温度110℃;样品瓶加热平衡时间10.0 min;取样针温度105 ℃;进样时间 1.0 min;样品瓶体积 10.0 mL。

2.2 溶液制备

用精密移液器取含有甲醇和乙醇的样品血0.50 mL加入样品瓶内，盖上硅橡胶垫，用密封钳加封铝帽，混匀。准确称取10.004 g甲醇标准品和10.007 g无水乙醇标准品(含量不小于99.9%)，分别置于100 mL容量瓶中，添加双蒸水至刻度，混匀，得100 g/L甲醇和乙醇贮备液，并将贮备液稀释得到质量浓度为 50，25，10，5，2.5 g/L 的甲醇和乙醇标准使用液。密封，冷藏保存。

2.3 检测条件选择

色谱条件:参考有关文献，并结合实验室仪器条件，进样口和检测器温度如2.1项，色谱柱温度依次设定为60，50，40℃，考察甲醇与乙醇的分离效率。结果发现在较高柱温(50℃和60℃)时甲醇与乙醇的分离度差，60℃时两物质的色谱峰甚至部分重叠。但当柱温为40℃时甲醇和乙醇可达基线分离，峰形良好，出峰稳定(见图1)。两 物 质 的 保 留 时 间 分 别 为 甲 醇(3.69±0.01)min，乙 醇(4.50±0.03)min。在此条件下，未见血液中内源性物质的干扰。

图1 气相色谱图

样品平衡温度:取0.475 mL空白血样，分别添加50 g/L的甲醇质量标准使用液15 μL和50 g/L的乙醇标准使用液10 μL，得到甲醇质量浓度为1.5 g/L、乙醇质量浓度为1.0 g/L的空白添加血样，考察45～75℃之间血液样品平衡温度对检测的影响。平衡时间均为10 min。在各个设定温度条件下分别检测3个平行样品，记录峰面积并计算 RSD。结果见表1。可见，甲醇和乙醇的峰面积随温度的升高而增加，在70℃和75℃时，甲醇和乙醇的峰面积变化最小，且在70℃两种物质的 RSD最小，检测结果稳定，故选择70℃作为样品平衡温度。

表1 平衡温度与血液中甲醇和乙醇峰面积的关系(n=3)

2.4 方法学考察

线性关系考察:取0.48 mL空白血样，分别添加10 μL质量浓度为 2.5，5，10，25，50，100 g/L 的甲醇和乙醇标准使用液，得到质量浓度为 0.05，0.1，0.2，0.5，1.0，2.0 g/L 甲醇和乙醇标准溶液，分别进样检测，以血液中甲醇和乙醇的质量浓度为横坐标(X)、甲醇和乙醇的峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，得回归方程，甲醇 Y=12 147 X －27.654，r=0.999 7;乙醇 Y=13 317 X －75.328，r=0.999 9。甲醇与乙醇的最低检出限为 0.01 g/L。

精密度与回收试验:取甲醇与乙醇配制质量浓度均为0.1，1.0，2.0 g/L的高、中、低3个质量浓度的空白添加血样，每个质量浓度各取份，以所建方法在3 d内进行检测，记录甲醇与乙醇峰面积，计算日内和日间精密度。同时计算测得量，按照测得量和添加量之比计算回收率(见表2)。结果表明，该方法具有较好的回收率。

表2 甲醇和乙醇的回收率和精密度(n=6，%)

干扰试验:在空白血样中加入乙醛、正丙醇、异丙醇、正丁醇、乙酸乙酯，在此条件下进行检测，这些物质峰形良好，分离度不低于1.5，对甲醇和乙醇的检测无干扰。

2.5 样品含量检测

取一送检的饮用可疑假酒者的血液，用上述所建立的方法检测，结果检出甲醇含量为0.12 g/L，乙醇含量1.36 g/L。

3 讨论

在血液乙醇的顶空气相色谱检测中，常用叔丁醇作为内标。但当有甲醇存在时，在建立顶空和气相色谱分析条件过程中发现叔丁醇与甲醇的出峰时间相近，互相干扰，两者无法区分。因此，本研究未采用内标法，而用外标法检测血液中的甲醇和乙醇。但在干扰试验中发现，乙醛、正丙醇、异丙醇、正丁醇、乙酸乙酯对甲醇和乙醇的检测均无干扰，而乙醛、正丙醇、正丁醇、乙酸乙酯常被作为酒类检测中的目标物，故在以后的研究中可考虑用异丙醇作为内标。所建立的方法同步检测全血中的甲醇和乙醇，样品处理简单，两者分离良好，回收率高，重复性好，无内源性物质干扰，分析时间短，为实际应用提供了快速的检测方法和依据。

[1]GB/T5009.48－2003，中华人民共和国国家标准(食品理化检验部分)[S].

[2]谢广明，潘叫全，刘泽春.人体组织和血液中残留甲醇检测方法探讨[J].公共卫生与预防医学，2010，21(3):83.

[3]林 佶，段毅宏，余晓萍.人体血液中甲醇的GC/MS定性定量分析[J].职业与健康，2005(2):213－214.

[4]李勇勤，谢秀红，许广荣，等.毛细管色谱柱顶空气相色谱法测定血中甲醇的含量[J].现代预防医学，2008(18):3 589－3 590.

[5]代 娟，陈 曼，赖 翼，等.直接进样毛细管气相色谱法测定血液中乙醇含量的研究[J].中国卫生检验杂志，2010(2):283－284.