LPS诱导下THP－1细胞基因表达内参基因的筛选1）

梁俊红，曹锡梅，万东方，张 潮，郭大玮

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是心脑血管疾病的主要病理基础，引起AS的病因很复杂。巨噬细胞在其发生、发展过程中有重要作用[1，2]。抑制巨噬细胞的炎症反应有可能成为预防和治疗AS的一个重要的方向。已知人单核白血病（THP－1）细胞具有单核细胞和巨噬细胞的功能和生理学特性，被广泛用于毒理学、免疫学和动脉粥样硬化等研究领域[3]。而G－细菌细胞膜的主要成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可以刺激单核巨噬细胞系统发生免疫反应[4]。明确LPS刺激THP－1细胞的基因转录水平将有助于揭示AS的病因。

实时定量PCR（RT－qPCR）较普通PCR定量准确、重现性好、灵敏度高，已经成为分析基因转录水平的首选方法[5－7]。然而，多种变量因素影响其数据处理和结果分析，如提取RNA的质量、酶的效率（反转录效率，扩增效率）等等。为了去除这些变量可能存在的差别而获得目标基因特异性表达的真正差异，实验者通常选择表达稳定的单一内参基因GAPDH或ACTB进行校正和标准化。然而越来越多的研究表明，某些条件下稳定表达的内参基因变得不再稳定[8，9]。为了确保RT－qPCR结果的可靠性，Bustin等[10]针对实验中的种种问题提出一套标准指南（MIQE指南）。本研究依据该标准指南共选取10个候选看家基因：ACTB、GAPDH、RPL37A、PPIB、PGK1、PPIA、SDHA、TBP、HPRT1、RPL13A ，通过 SYBR－Green RT－qPCR技术对LPS刺激THP－1细胞的基因转录水平进行检测，评估不同条件下适合此细胞基因表达水平研究的内参基因，以确保后期RT－qPCR实验结果的准确性和可靠性。

1 材料与方法

1.1 THP－1细胞培养与样本采集 THP－1细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库（TCHu－57），用含10%FBS（Gibco 10099－141，购自北京茂建）的 RPMI－1640（Hyclone，SH30809.01B）培养基，37℃，5%CO2的细胞培养箱培养。稳定培养传2代～3代后给予Lipopolysaccharide（LPS，Sigma，L2880，10μg／mL）刺激。实验设计LPS刺激 THP－1细胞不同时间点：LPS刺激0h、2h、6h、12h、24h。

1.2 总RNA提取纯化与反转录 依照说明书使用TransZol Up（ET111－01，北京全式金生物技术有限公司）抽提上述5个时间点THP－1细胞的总RNA，DNaseI（D2215，TaKaRa大连宝生物工程有限公司）去除基因组DNA的污染，紫外分光光度计测定每个样本RNA的浓度与纯度。参照反转录PrimeScriptTM－reagent kit（DRR037S，TaKaRa大连宝生物工程有限公司）说明书，以400ng总RNA为模板合成cDNA，同时设阴性对照。

1.3 实时定量PCR 实验中涉及的所有内参基因的基因序列均来自于GenBank。采用Allele ID6对序列进行分析，并设计适合于SYBR Green的特异性上、下游引物（见表1），委托上海英骏公司（Invitrogen）合成。RT－qPCR反应总体系为20μL，包括2×SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa）10μL、ROX 0.2μL、10 μmol／L上下游引物各0.4μL、cDNA模板1μL、ddH2O补齐余体积。Stratagene实时荧光定量仪Mx3000p运行，反应条件为95℃预变性5s、95℃变性5s、55℃退火30s、72℃延伸30 s并收集荧光，40个循环，57℃～95℃生成熔解曲线。每个样品3次重复。经过Mx3000p软件分析，可以得到各内参基因的循环阈值（Ct）。

表1 RT－qPCR中所用候选看家基因引物

1.4 实时定量PCR扩增效率的验证 以cDNA第一链为模板，做梯度稀释。依次做5个梯度稀释后cDNA初始浓度分别为1／10、1／102、1／103、1／104、1／105。每个反应重复2次，通过RT－qPCR分析相关系数，扩增效率等通过Stratagene实时荧光定量PCR仪Mx3000P自带软件得到。

1.5 数据分析 根据qRT－PCR定量分析结果，利用GeNorm和NormFinder软件对各候选内参基因在LPS刺激不同时间后的表达稳定性进行统计学分析，从而筛选出最优的内参基因。

2 结 果

2.1 内参基因引物特异性 普通PCR扩增、1%琼脂糖凝胶电泳检测每个内参基因引物的特异性，结果如图1所示，各引物条带清晰，扩增产物片段大小正确。各内参基因的溶解曲线均为单一峰，证明内参基因引物特异性良好。

图1 10个候选内参基因1%琼脂糖凝胶电泳结果

2.2 荧光定量PCR的效率（见表2） 10个候选内参基因的标准曲线R2值变化范围为0.990～0.999，表明cDNA初始模板量与其相应的Ct值线性关系较好。

表2 10个候选内参基因标准曲线斜率、相关系数及PCR扩增效率

2.3 NormFinder软件分析 5个样本经10个候选基因的特异性引物扩增后，Ct值分布如图2所示，由图可知GAPDH、PGK1Ct值比较稳定。

经GenEx软件中Normfinder分析，10个候选内参基因的组内标准差如图3所示，经过分析，Normfinder选择GAPDH（SD＝0.0951）为最佳基因，说明在分析LPS刺激后THP－1细胞mRNA的表达量时GAPDH的变化最小，而RPL13A（SD＝1.539 4）最不稳定。

图2 候选内参基因经Normfinder分析后稳定性排列

2.4 GeNorm软件分析结果 Genorm软件通过分析内参基因在不同样品中的表达稳定性（M）来确定最稳定的内参基因，但该程序基于标准差，默认M＝0.5为取舍值。若某内参基因的M值小于0.5，可考虑将其作为内参基因。M值越大表示其稳定性越差；反之，稳定性越好。由图3可知，候选内参基因的稳定性为GAPHD＝PGK1＞PPIB＞RPL37A＞HPRT1＞ACTB＞PPIA＞SDHA＞TBP＞RPL13A。GAPDH、PGK1稳定性好，适合作为LPS刺激下THP－1细胞基因表达分析的内参基因。

表3 GeNorm软件分析候选内参基因在LPS刺激THP－1不同时间后的表达稳定性

3 讨 论

RT－PCR是分析基因转录水平的首选方法，为了确保其结果的准确性和可靠性，选择合适的内参基因是非常重要的一个环节。内参基因通常是各种看家基因，在细胞内组成性表达，有助于保持细胞的功能。由于内外环境的变化，在细胞内真正恒定表达的基因并不存在。RT－PCR实验中选择的理想内参基因应该满足以下条件：①不存在假基因，避免基因组DNA的扩增；②表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关；③稳定表达于不同类型的细胞和组织（如正常细胞和癌细胞），且其表达量是近似的，无显著性差别；④高度或中度表达，排除太高或低表达；⑤其稳定的表达水平与目标基因相似；⑥不受任何内源性或外源性因素的影响，如不受任何实验处理措施的影响。实际上能满足这些条件的基因几乎是不存在的，目前所研究的基因（包括看家基因）在不同类型的细胞、组织及实验条件下表达均有差异[11]，研究者有必要针对不同的实验条件、分析寻找适合各自实验系统的特异性稳定表达的内参基因。

本研究依据MIQE指南共选取10个候选看家基因，采用NormFinder和GeNorm软件评估不同条件下适合THP－1细胞基因表达水平研究的内参基因。NormFinder软件经标准曲线或ΔCt法将原始数据转换成线性表达量，然后通过方差分析得出基因的表达稳定值 M，可以直接评价基因的稳定性[12]。GeNorm软件是通过分析内参基因的表达稳定值来筛选内参基因[13]。原始数据先经 2– ΔCt（EMinCt－SampleCt）法转换成相对表达量输入Excel表格，GeNorm软件将每个候选内参基因与其他候选基因的配对表达水平比值进行对数变换，计算出标准差作为基因表达稳定值M，然后对所有候选内参基因的表达稳定性排序。根据NormFinder和GeNorm软件分析得出本实验中GAPDH和PGK1是表达最稳定的内参基因。RT－PCR进行基因转录分析中选择一个以上的内参基因作内参可以得到更可靠的结果[14]，为确保后期RT－qPCR实验结果的准确性和可靠性，同时选用GAPDH和PGK1校正目的基因表达。

总之，RT－PCR实验中研究者应该根据细胞和组织的类型及不同实验条件，选择最合适的内参基因，选择2个或2个以上的内参基因将有助于得到更可靠的结果。

[1]Davis NE.Atherosclerosis－－an inflammatory process[J].J Insur Med，2005，37（1）：72－75.

[2]Breland UM，Michelsen AE，Skjelland M，etal.Raised MCP－4levels in symptomatic carotid atherosclerosis：An inflammatory link between platelet and monocyte activation[J].Cardiovasc Res，2010，86（2）：265－273.

[3]Auwerx J.The human leukemia cell line，THP－1：A multifaceted model for the study of monocyte－macrophage differentiation[J].Experientia，1991，47（1）：22－31.

[4]Brandtzaeg P，Bjerre A，Ovstebo R，etal.Neisseria meningitides lipopolysaccharides in human pathology[J].J Endotoxin Res，2001，7（6）：401－420.

[5]Bustin SA，Benes V，Nolan T，etal.Quantitative real－time RTPCR －aperspective[J].J Mol Endocrinol，2005，34（3）：597－601.

[6]Kubista M，Andrade J M，Bengtsson M，etal.The real－time polymerase chain reaction[J].Mol Aspects Med，2006，27（2－3）：95－125.

[7]VanGuilder HD，Vrana KE，Freeman WM.Twenty－five years quantitative PCR for gene expression analysis[J].Biotechniques，2008，44（5）：619－626.

[8]Bustin SA.Absolute quantification of mRNA using real－time reverse transcription polymerase chain reaction assays[J].J Mol Endocrinol，2000，25（2）：169－193.

[9]Thellin O，Zorzi W，Lakaye B，etal.Housekeeping genes as internal standards：Use and limits[J].J Biotech，1999，75（2－3 ）：291－295.

[10]Bustin SA，Benes V，Garson JA，etal.The MIQE guidelines：Minimum information for publication of quantitative real－time PCR experiments[J].Clin Chem，2009，55（4）：611－622.

[11]Lee PD，Sladek R，Greenwood CM，etal.Control genes and variability：Absence of ubiquitous reference transcripts in diverse mammalian expression studies[J].Genome Res，2002，12（2）：292－297.

[12]Andersen CL，Jensen JL.Normalization of real－time quantitative reverse transcription－PCR data：A model－based variance estimation approach to identify genes suited for normalization，applied to bladder and colon cancer data sets[J].Cancer Res，2004，64（15）：5245－5250.

[13]Vandesompele J，De PK，Pattyn F，etal.Accurate normalization of real－time quantitative RT－PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes[J].Genome Biol，2002，3（7）：1－11.

[14]Schmid H，Cohen CD，Hanger A，etal.Validation of endogenous controls for gene expression analysis in microdissected human renal biopsies[J].Kidney Int，2003，64（1）：356－360.