CHLH的ABA受体之争

任杰 冷平 孙福山 徐秀红

植物激素脱落酸（abscisic acid，ABA）调控植物生长和发育的许多方面，如果实的发育成熟［1-5］、种子成熟、萌发和幼苗生长，并且作为一种核心激素通过调节气孔开闭和胁迫响应基因的表达来调控植物适用环境胁迫，如干旱、盐害和冷害等［6，7］。作为一种植物激素信号，ABA首先必须被靶细胞质膜或内膜体系上（或胞液中）所具有的特异受体蛋白所识别，才能经过一系列信号转导和传递等过程，启动特异的生理生化反应，或产生发育过程的转换［8］，即ABA信号的细胞内转导起始于ABA受体对ABA信号的感知。

ABA受体是ABA信号路径中最上游的组分，这一研究领域受到了科研工作者的广泛关注。近年来，脱落酸受体鉴定工作在模式植物上取得了实质性突破。这些受体，一类是细胞质膜上常规的G 蛋白偶联受体GCR2 和新型的G 蛋白偶联受体GTG1、GTG2［9，10］，另一类是含有 START 特征区的 ABA 受体 PYR/PYL/RCAR［11-13］，还有一类是定位于质体/叶绿体内参与叶绿素合成的镁离子螯合酶H 亚基的ABA 受 体 ABAR/CHLH［14-16］。 本 文 仅 就 CHLH 与ABA信号传递的关系作一综述。

1 CHLH是否为ABA受体

镁螯合酶H亚基（CHLH）通过催化镁卟啉的生成而参与叶绿素合成，还参与介导从叶绿体到细胞核的反向信号转导［17-21］，是一个多功能的蛋白质。但是对于CHLH是否为ABA 受体目前仍存在较大争议。Shen等［14］在拟南芥（Arabidopsis thaliana）上证明CHLH蛋白能与（+）-ABA特异结合，而且，CHLH-ABA结合的动力学符合受体-配体结合的所有特征。超表达CHLH和RNAi改变了ABA结合位点的数量，但是没有改变其与ABA的亲和力。这说明CHLH能特异性结合ABA，并且这些结合具备了ABA受体的基本特征。但是Müller和Hansson［22］在大麦（Hordeum vulgare）上的研究指出大麦XanF基因（拟南芥CHLH同源基因）突变导致的叶绿素缺陷突变体在种子萌发、幼苗生长和气孔运动方面并没有ABA相关表型，并且并没有检测到XanF与ABA的结合活性，这说明大麦CHLH不是ABA受体或者单子叶植物CHLH蛋白在与ABA结合和信号传递方面与双子叶植物不同。这一研究结果对CHLH作为ABA受体的结论提出质疑。

针对大麦上的研究结果，Wu等［15］利用一项新的ABA免疫亲和层析技术提出了CHLH作为ABA受体的新证据，研究指出，CHLH通过C端半段而非N端半段特异性结合ABA（图1）。与此一致，通过转基因操作提供的遗传学证据也支持了这一结论。通过基因重组技术在野生型拟南芥中分段表达CHLH C-半端蛋白可以导致植株在种子萌发、幼苗生长和气孔运动这3个主要表型上对ABA全面超敏，在ABA不敏感型CHLH突变体cch中表达C端区段蛋白则能恢复突变体对ABA的响应。而不结合ABA的N端区段的作用仅限于调节种子萌发或幼苗生长之其中之一。这些新发现支持了CHLH是ABA受体的观点，并说明CHLH C端在ABA信号传递过程中发挥核心功能，其不但是结合ABA的核心区域，而且相应地也是介导ABA信号的核心区域。此外Wu等研究发现大麦和水稻（Oryza sativa）CHLH能够结合ABA。基于这些研究结果，研究认为，之所以没有检测到大麦XanF对ABA的特异性结合，可能是因为放射性ABA测定体系中的蛋白质在试验过程中被训练不足的研究人员全部除去了［15，23］。此外，Shang等［16］将大麦XanF基因导入拟南芥野生型植株，导致植株对ABA超敏，将XanF基因导入拟南芥cch突变体也恢复了该突变体在种子萌发、幼苗生长和气孔运动方面的ABA脱敏表型。这些事实说明，大麦XanF与拟南芥CHLH一样是一个ABA受体。

但是，Tsuzuki等［24］通过人工诱变的方法获得了一个拟南芥CHLH突变体rtl1，研究表明rtl1和拟南芥RNAi株系在气孔运动方面表现对ABA脱敏，但rtl1表型在种子萌发和根系生长方面仍然对ABA敏感。此外，利用H3标记的ABA结合试验表明ABA不能与重组的CHLH结合，但能与另一个公认的ABA受体PYR1特异性结合。研究指出CHLH影响了ABA介导的保卫细胞的气孔运动，但并未影响种子萌发和根系生长，因此认为CHLH能够影响保卫细胞对ABA的敏感性，但并不是一个ABA受体，再次对CHLH是ABA受体的结论提出质疑。

图1 CHLH分子的功能区域模型［23］

2 CHLH正向调节ABA信号是否转导

Shen 等［14］通过转基因技术上调或下调CHLH基因的表达，以及利用CHLH基因点突变的突变体遗传材料证明CHLH是ABA信号的正调节子。CHLH基因表达下调的拟南芥株系在ABA抑制的种子萌发、幼苗生长以及ABA诱导的气孔关闭方面表现出显著的ABA不敏感表型。与此相反，CHLH基因表达上调的拟南芥株系在这3种反应方面表现出对ABA超敏表型，并且其叶片和植株更能忍耐干旱胁迫。总的来说，CHLH水平与ABA不敏感表型强度负相关，这说明CHLH作为一个正调控因子介导了ABA信号传递。此外，通过RNAi下调CHLH基因的表达，同时也降低了叶片中ABA信号传递路径正调控因子 RD29A、MYB2、MYC2、ABI4、ABI5 和OST1的表达，促进了3个负调控因子ABI1、ABI2和CIPK15的表达。种子特异性ABA信号传递基因ABI3、ABI4和ABI5及其下游与胚形成有关的基因EM1和EM6在RNAi植株长角果中的表达都下降。而CHLH超表达株系中这些基因的表达与RNAi株系相反。进一步证明了CHLH是正调控因子，并且可能通过多种途径发挥作用。此外，研究还发现CHLH作为一个蛋白普遍存在于绿色和非绿色组织中。因此，CHLH可能在植物整体水平上感知ABA信号［14］。对草莓果实的研究表明，随着果实的加速褪绿，FaCHLH基因表达量迅速降低，至白果期降到最低点；随着果实着色启动，其表达量又迅速上升。因此认为CHLH基因可能参与果实的褪绿和着色过程。通过 ABA 处理草莓果实圆片温育试验表明，随着ABA 浓度的增加，FaCHLH 表达量呈显著上升的趋势，因此认为草莓果实中CHLH 基因的转录受ABA 诱导，是正调控因子［25］。

但是与以上研究结果不同，Ren等［26］从甜樱桃果实中克隆了一个CHLH同源基因PacCHLH1。PacCHLH1推测的氨基酸序列与拟南芥、桃、草莓和葡萄等的CHLH相应片段的同源性都在90％以上，但是PacCHLH1在甜樱桃果实中的表达模式与CHLH在拟南芥和草莓果实中的表达模式有很大差别。PacCHLH1在甜樱桃果实中的表达在果实成熟启动时急剧下降，在果实成熟前4d降至最低值，之后至果实成熟则一直维持在这一低水平，与ABA含量在这一时期的变化表现出相反的趋势（图2）。此外，研究表明，外源ABA不但没有促进反而显著抑制了PacCHLH1在果实中的表达。这些结果与CHLH作为叶绿素合成关键酶的性质是一致的，在甜樱桃的成熟过程中，叶绿素含量急剧下降，与PacCHLH1转录水平变化相一致。此外，ABA能促进叶绿素的分解，而抑制叶绿素合成关键酶基因CHLH的表达。这些结果说明，PacCHLH1与甜樱桃果实叶绿素的合成有关。研究还发现，水分胁迫对果实PacCHLH1的表达并无显著影响，但显著促进了PacCHLH1在叶片中的表达，PacCHLH1在生殖器官和营养组织中表现出不同的表达模式［26］。这些研究表明，PacCHLH1在果实成熟过程中的表达与ABA表现出相反趋势，外源ABA抑制了PacCHLH1在果实中的表达，与CHLH作为正调控因子介导ABA信号传递的结果不一致。但是PacCHLH1又能响应叶片水分胁迫，这一结果与其作为正调控因子介导ABA信号传递的结果一致。

图2 甜樱桃果实成熟过程中PacCHLH1的表达及ABA含量变化［26］

3 CHLH对ABA信号向下游转导的机制

CHLH是一个叶绿体蛋白，其如何向细胞质或通过细胞质向细胞核进行信号传递成为必须解决的一个问题。Shang等［16］利用分子生物学、生物化学和细胞生物学等多种技术研究发现CHLH横跨在叶绿体被膜上，其C端和N端暴露在细胞质中，这就为CHLH从叶绿体向细胞质-细胞核传递信号提供了可能。进一步的研究表明，暴露在细胞液中的C端部分与一组在种子萌发和幼苗生长中负调控ABA信号传递的WRKY转录因子（WRKY40、WRKY18和WRKY60）相互作用，其中WRKY40是核心负调控因子，抑制下游重要的ABA信号调节子基因如ABI4、ABI5、ABF4和MYB2等基因的表达，从而负调控ABA信号通路。通过一系列遗传学、生物化学和细胞学试验，Shang等［16］提出了CHLH-WRKY40相偶联的ABA信号级联通路模型。该模型指出，CHLH与ABA信号分子结合后，可以刺激WRKY40从细胞核到细胞质的转移，促进CHLH与WRKY40的相互作用，进而激发一种未知因子（或信号系统），阻遏WRKY40的表达，从而解除WRKY40对ABA响应基因转录的抑制，最终实现ABA的生理效应（图3）。这些发现描述了一条从早期信号事件到下游基因表达的ABA信号路径。

4 小结

综上所述，有关CHLH作为ABA受体的研究还是集中在种子萌发、幼苗生长及对环境胁迫方面，且均是以传统遗传学技术为研究手段，研究结果不尽相同，至今仍存在较大争议。有关CHLH空间结构和结构域功能的研究，特别是结合ABA 的结构域的研究还未见报道。要想彻底阐明CHLH是否为ABA受体，需在CHLH的结构生物学研究方面取得进展，以便在亚分子水平上深入揭示CHLH结合ABA和感知ABA信号的机制。

图3 CHLH介导的信号传递模型［23］

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