植物响应低磷胁迫的功能基因组研究进展

邢国芳 郭平毅

磷作为植物生长发育所必需的大量元素之一，几乎参与了植物所有的生命活动过程。土壤中的磷大多数以无效态的形式存在，而能被植物吸收利用的有效态的磷含量通常在1μmol/L左右，远不能满足植物获取充足磷营养的需求，土壤有效供磷不足已经成为我国乃至全世界农业生产中限制谷物产量的主要因素之一。据统计，全世界130亿hm2的耕地中，缺磷耕地占43％［1］，我国耕地中约有2/3的土壤缺磷［2］。另外，由于磷肥是不可再生资源，据估计全世界磷矿储藏量在未来的几十年将被耗尽［3］，而且，大量施用磷肥，将消耗大量资源，增加农业生产成本，与此同时还将带来环境污染。因此，在世界范围内，缺磷已经成为限制作物生长和影响作物产量的主要非生物胁迫之一［4］。

基因组学（genomics）是20世纪90年代以来兴起的一门新兴学科，是指对生物的所有基因进行基因组作图，核苷酸序列分析，基因定位和基因功能分析的一门科学［5］。功能基因组学（functional genomics）又称后基因组学（postgenomics），是在基因组学的基础上通过新的技术和手段（如差减杂交技术、cDNA芯片、高通量测序和蛋白质双向电泳技术等）全面系统地解析基因的功能，其研究的主要内容包括基因功能的发现、基因组的表达及时空调控及蛋白质组［6］。

应用功能基因组学技术阐明植物对低磷胁迫响应的分子机制，已成为科学领域的一大热点，近期很多科研机构开展了植物耐低磷胁迫应答相关的功能基因组学研究，这无疑能促进人们对于植物耐低磷胁迫机制的系统认识，也更有助于作物耐低磷胁迫的分子育种。

1 植物适应低磷胁迫的形态变化

当外界的磷浓度低于一定水平时，植物就会适时地作出一些反应，这种适应性变化能够提高植物的磷吸收并加强体内磷的代谢能力，从而提高磷的利用效率。例如，植物在缺磷条件下，主根的生长受到抑制，而侧根的数量和长度增加，从而扩大了根系对土壤磷的吸收面积，提高其对磷的吸收效率，进而提高植物对磷胁迫的适应能力［7］。缺磷可以促进根毛的形成，使根毛的长度和密度增加，以促进根系对磷的吸收［8］，相关报道表明植物需磷量的60％是由根毛吸收的［9］。缺磷还可导致植物根系构型发生改变，使基部根的向地性反应减弱，根系分布变浅，根系生长角度变小，从而增大了在土壤有效磷含量较高区域的根系分布密度，进而提高了根系对磷的吸收效率［10］。另外，缺磷还能影响植物光合作用和碳水化合物的分配，导致在低磷条件下，植物的根冠比增加［11，12］，对磷利用率高效的物种（如小麦、燕麦）的根冠比普遍大于磷低效的物种（如洋葱、番茄和大豆），即使同一物种在低磷条件下，根系的生长量也会较正常磷水平条件下明显增加［13］。最后，在缺磷条件下植物的地上部分也表现出明显的症状，如植株矮小，生物量降低，叶片颜色变紫，花青素积累，抗性减弱，植物的营养周期变短，提前开花完成生活史等［14］。此外，一些植物如豆科植物白羽扇豆在遇到低磷胁迫时，可以形成排根（又称簇生根），来提高植物根系与土壤的接触面积，从而提高根系对磷的吸收能力［15，16］。

2 低磷胁迫前后基因的差异表达谱

植物体对低磷响应的一系列适应性变化过程是某些基因时空表达的结果。因此，许多研究者构建磷胁迫诱导的表达谱，对磷胁迫诱导的基因进行高通量的深入分析和功能研究，相继在拟南芥、水稻、玉米和大豆等作物中发现低磷胁迫后大量的基因差异表达，而且差异基因几乎涉及到生理生化的所有途经［17-20］。Wu 等［21］和 Misson 等［22］分别采用Microarray和Affymetrix芯片技术在拟南芥中发现：磷胁迫前后有相当一部分基因的表达发生了改变，且存在时空表达差异性，差异基因几乎涉及到拟南芥所有的代谢途径。Wasaki等［23］采用cDNAarray的方法对水稻磷胁迫不同时期的表达谱分析发现：磷胁迫后糖酵解途经、碳代谢途径、脂代谢途经、硫脂的合成和代谢，以及细胞壁的组分，金属离子的代谢的相关基因的表达均发生了变化。Morcuende等［17］结合拟南芥Affymetrix芯片和qRT-PCR表达分析以及部分代谢关键酶活性的测定发现，1000个以上的基因受到磷水平变化的调节。该研究还表明转录水平的变化并不必然导致蛋白或酶学水平的改变。综合转录组的研究结果，根据低磷胁迫响应基因的表达模式，可以将它们分成两类：一类是早期快速响应基因，研究发现在拟南芥中，低磷胁迫24-72d后，磷浓度发生变化，但植株的生物量未受到影响，所以这段时间内诱导表达的基因称为早期响应基因。这些基因多数不是低磷胁迫的特异响应基因，且在其启动子区，PHO和TATA-box元件出现的频率较高［14］；另一类是低磷胁迫晚期响应基因，其中大部分是随着低磷胁迫的加剧而诱导表达的，是与低磷胁迫下植物形态、生理和代谢反应相关的基因［14］。近年来蛋白质组学的发展也为磷胁迫研究提供了新的手段。张举仁教授实验室采用2-D技术结合质谱鉴定了玉米缺磷胁迫17d后蛋白水平的变化发现，差异蛋白涉及碳代谢、激素合成，细胞周期和信号转导等途径，并进一步通过突变体分析发现，在低磷条件下，根系中有13.6％的蛋白存在质和量的显著差异［24，25］。冯万军等［26］采用蛋白质双向电泳在小麦中检测到1144个蛋白点，有 87个在磷胁迫前后发生了表达变化，其中39个通过质谱技术鉴定涉及到代谢、转录调控等功能类别。这些结果也进一步印证了转录水平的研究结果。

3 磷胁迫前后差异表达基因的功能类别

综合前人在转录和蛋白质组上的研究结果发现，磷胁迫相关的基因涉及到各个功能类别，包括代谢、发育过程、转录和翻译、胁迫响应等多个分子生物学途径，其中代谢相关基因为最多。例如，Hernández等［20］对菜豆在缺磷和富磷条件下进行功能基因组学研究发现，有126个基因差异表达，其中上调表达的基因有78个，编码产物分别参与次生代谢途径/胁迫与防御反应（23％）、磷循环、碳代谢、氮代谢、酯类代谢和氨基酸/蛋白质合成和降解（24％）、膜蛋白/胞内和胞间运输（13％）和细胞结构/细胞周期/发育（8％），功能未知的基因占9％。缺磷的根中下调表达的基因有48个，最大的一类基因（11个，23％）参与氨基酸和蛋白质代谢，参与C/N代谢途径的有5个基因（10％），属于转运/膜蛋白类和细胞结构/细胞周期/发育蛋白类的基因分别有9个（19％）和7个（15％），参与调控/信号转导和次生代谢/防御途径的基因分别占8％和6％。在过去的10年间，一些对低磷胁迫响应基因相继被分离鉴定。例如，Wasaki 等［23］在白羽扇豆中发现，酸性磷酸酶（ACP）基因在低磷胁迫下的排根中表达，其活性增强有利于土壤中有机磷的分解。分离出了负责植物体中磷的吸收和转运的磷转运子，其主要包括Pht1、Pht2 Pht3、Pho1和Pho2五大家族成员［27，28］、各种低磷胁迫反应的调控基因-转录因子基因如MYB类转录因子PHR1，PHR2，受低磷诱导表达的WRKY类转录因子WRKY75，锌指类转录因子ZAT6和BHLH类转录因子BHLH32［29-33］，以及与磷吸收利用有关的核酸酶（RNases）基因等［34］。这些基因通过复杂的调控网络参与植物对低磷的应答。

4 植物响应低磷胁迫的基因表达网络

植物通过体内的信号感受器获得土壤有效磷缺乏的低磷胁迫信号，通过复杂的信号转导，启动体内与磷胁迫相关的基因表达，通过调控植物体内的生理生化过程，最终表现出一系列与低磷胁迫有关的形态特征，如地下部根系的变化-主根变短，侧根、根毛的数目和密度增加，根冠比增加以及地上部的变化-花青素的积累增加等。Schachtman等［35］总结了目前已经鉴定的与低磷反应相关的基因，包括激素受体、转录因子、磷转运蛋白及小RNA等（图1）。这些基因的产物有的参与了低磷反应信号转导过程，如细胞分裂素受体CRE1磷浓度变化的指示剂；转录因子PHR1是目前发现的低磷反应的关键调控因子［36］；编码z2型磷脂酶D的基因（PLDz2）既参与低磷条件下植物根系的形态发生，又参与植物体中脂类成分的转换；泛素连接酶PHO2、小RNA基因miR399以及磷转运蛋白基因等是低磷反应调控网络中的下游基因，它们共同维持低磷条件下植物体磷稳态；SIZ1是一个植物小泛素样修饰子（small ubiquitin-likemodifier，SUMO），即一个E3连接酶，是控制低磷反应的关键因子，低磷胁迫时可以促使PHR1蛋白发生SUMO化，从而激活一系列低磷反应，并且负调控一些低磷响应的下游基因如PSI、At4等的表达［37］。目前认为以转录因子PHR1为中心，包括小RNA及蛋白泛素化途径，是迄今为止首次发现的磷胁迫信号的转录后调控途径［38］。

图1 植物体在正常及缺磷条件下的调控网络系统［35］

5 非编码RNA参与的植物耐低磷胁迫途径

目前关于非编码RNA与植物耐低磷胁迫的研究报道较少，且主要集中于模式植物拟南芥。

5.1 小分子非编码RNA参与的低磷胁迫信号机制

Bari等［39］报道，miR399作为一种长距离信号调节植株体内的磷稳态，并通过系统分析PHO2、miR399和PHR1基因在磷胁迫诱导后的表达模式，提出了它们之间的上下游调控网络（图2）。推测miR399的靶基因是PHO2（AtUBC24），其编码泛素化蛋白降解途径中的泛素连接酶E2［38-40］。miR399由核基因编码，成熟的miRNA399进入细胞质后与PHO2mRNA 3'端非编码区的互补序列结合，诱发靶mRNA降解或抑制蛋白质翻译。磷饥饿时诱导miRNA399表达，同时E2连接酶基因UBC24的表达受到抑制，而供磷恢复后miR399的表达水平则快速下降，使得UBC24的表达抑制被解除，这样就提供了一个机制，即供磷水平在转录水平上调节miR399的表达丰度，进而调控植物体内与磷分配相关基因的表达，从而维持植物体内的磷稳态。Pant等［41］通过微嫁接试验，进一步证实miR399是通过韧皮部从地上部茎转运到地下部根系，作为一种长距离信号调节植物体磷稳态。我们在玉米中研究发现小分析非编码RNAmiR399以及miR447在磷胁迫后迅速发生差异表达，表明其参与玉米对低磷胁迫的响应（结果未发表）。

5.2 长链非编码RNA（lncRNA）与植物耐低磷胁迫的关系

有资料显示，lncRNA TPSI1/Mt4基因家族成员参与了拟南芥植株体内磷的分配和磷稳态调控［42］。在磷饥饿条件下，家族成员At4在维管组织中被诱导表达，在低磷条件下，at4根吸收磷的速度下降而向地上部的转运速率增加，结果导致根中无机磷含量降低。该家族的另一成员AtIPS1，受磷饥饿诱导表达，且在野生型中表现为组成型表达；而在富磷环境下的pho1突变体内，AtIPS1的表达则仅限于根的内皮层中。表明其控制植株体内磷分配的系统信号是以负调控的方式发挥作用［42］。

随着基因芯片及高通量测序技术的发展，一些新的低磷胁迫相关的非编码RNA的发现，为这一领域的研究提供了更详实的证据［43］。miR399包括多个家族成员，在玉米和水稻中分别有10和11个。miR399及其靶基因PHO2/UBC24在单子叶和双子叶植物之间相当保守［44］。

6 植物激素参与低磷胁迫信号的传导

目前认为植物激素细胞分裂素（CTK）参与了植物对体内磷营养信号通路的感应［45］，在低磷条件下植物体内CTK含量显著降低，外源施加CTK可以抑制低磷响应基因IPS1、At4等基因的表达［46］。生长素也可能在植物根系响应低磷反应中起重要作用，据报道低磷胁迫增加拟南芥根系对生长素的敏感性，并且外源生长素处理可以使高磷植株表现出低磷条件下的形态特征［47］。徐中平［48］发现，低磷使得玉米植株根系的构型发生了改变，这与生长素和玉米素在根部的水平和分布以及两种激素浓度比例的变化有关。Borch等［49］发现，在低磷胁迫条件下，菜豆根系中乙烯含量增加且表型发生变化，乙烯还参与低磷胁迫条件下拟南芥主根的伸长和根毛的形成［50］。此外，ABA和赤霉素等植物激素、糖信号和包括JA在内的生物逆境调节途径可能也参与了磷胁迫基因的调节。

图 2miRNA399介导的磷胁迫信号转导途径［38］

7 展望

植物在低磷胁迫条件下，体内的新陈代谢、生理生化反应发生改变，进而导致根系以及地上部发生变化，这些适应性改变有利于提高植物对土壤中磷的吸收利用效率，降低植物对低磷胁迫所造成的伤害。近年来，一些与磷吸收和利用以及低磷胁迫下根系发育相关的突变体被筛选出来，低磷胁迫导致根系发育异常的分子机制研究取得了很大进展。研究发现相关蛋白、激素、转录因子基因通过复杂的代谢网络调控低磷胁迫下植物的生长发育，但这一复杂的基因调控网络目前尚未解析，采用转录组测序以及功能基因组研究技术，将有助于深入解析相关基因的功能及其参与的代谢网络的调控机制。另外，由于目前对于低磷胁迫分子机制的研究多集中于模式植物拟南芥中，在相关作物中的研究相对较少，相信借助于拟南芥的研究成果，解析植物耐低磷的分子机制，克隆重要候选基因，对于培育磷高效的作物新品种将具有深远的意义。

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