镉损伤小鼠心脏形态学研究及咖啡酸苯乙酯的保护作用

陈福欣，龚 频，王 静，马养民*，周安宁

1西安科技大学化学与化工学院，西安 710054;2教育部轻化工助剂化学与技术重点实验室，陕西科技大学，生命与工程学院，化学与化工学院，西安 710021

重金属镉是一种分布广泛、毒性持久的环境污染物。极低剂量的镉中毒就能诱导心血管疾病的发生［1，2］，有研究发现其毒性与氧化应激有关;但其毒性作用机制尚未明确。我们之前的研究发现，咖啡酸苯乙酯(CAPE)对镉诱导的心脏损伤具有保护作用［3］，可能与其抗氧化作用有关。但目前通过直观的组织形态学观察证实镉对心脏的损伤以及CAPE的保护作用鲜见报道。本研究利用光镜技术观察了镉对小鼠心脏的损伤作用及CAPE对心脏损伤的保护作用，并探讨了CAPE的保护作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

雄性昆明小鼠30只，鼠龄1个月左右，20 g左右，购自第四军医大学实验动物中心，实验前适应性饲养3 d，自由取食饮水。CAPE合成于本实验室，其化学结构通过1H-NMR(Burker，400 MHz)和质谱(Mariner 5074，Framingham，MA，USA)验证，纯度经高效液相色谱分析达98%。氯化镉(CdCl2)购自天津市福晨化学试剂厂，生理盐水购自西安京西双鹤药业有限公司，苏木精、曙红、N-(1-萘基)-乙二胺、对氨基苯磺酸购自瑞士阿达玛斯公司，其他试剂为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 动物分组和模型构建

随机将小鼠分成5组、每组6只，空白组(A组):腹腔注射生理盐水0.2 mL;镉损伤组(B组):腹腔注射 CdCl2水溶液1 mg/(kg·d);低剂量CAPE保护组(C组):分别腹腔注射CdCl21 mg/(kg·d)和 CAPE 0.1 μM/(kg·d);中剂量 CAPE 保护组(D组):分别腹腔注射CdCl21 mg/(kg·d)和CAPE 1 μM/(kg·d);高剂量CAPE保护组(E组):分别腹腔注射CdCl21 mg/(kg·d)和CAPE 10 μM/(kg·d)。每天给药1次，持续给药7 d。根据小鼠心肌脂质过氧化反应的程度来判断模型是否构建成功［3］。

1.2.2 组织形态学切片的制作

最后1次注药24 h后，断颈处死小鼠，取新鲜心脏组织保存在10%的福尔马林中，梯度脱水，包埋于石蜡，制作厚度为5 μm的切片，苏木精—曙红染色，400×光镜下观察心肌细胞形态。

1.2.3 NO 的含量测定

取新鲜心脏组织，用预冷的磷酸缓冲液(pH 7.4)匀浆，100 μL 样品加入等体积的 0.1%N-(1-萘基)-乙二胺、1%对氨基苯磺酸，利用Griess反应来测定心脏组织中NO的含量。原理:碱性环境下，溶液中的NO-2可与对氨基苯磺酸发生重氮化反应，再与N-(1-萘基)-乙二胺偶联，生成紫红色产物，测量其在540 nm下的吸光值，由测定的NO-2含量间接的反映NO的含量。实验重复3次，取平均值。

1.2.4 CAPE的金属螯合能力检测

CAPE与二价铁离子的螯合实验按照Gong等［4］的方法进行。不同体积、浓度为1 mg/mL的CAPE加入到1 mmol/L的(NH4)2Fe(SO4)2(溶于NaAc-HAc缓冲液，pH 5.0)溶液中，通过加入 4 mmol/L的邻菲罗啉(溶于 NaAc-HAc缓冲液，pH 5.0)来起始反应，反复振荡混合物，室温下静置10 min。当反应达到平衡后，于510 nm检测吸收值。重复3次，取均值。Fe2+-邻菲罗啉一水化物复合体形成的抑制百分比=(1－A1/A0)×100%。其中A0是空白的吸收值，A1是含有CAPE样品的吸收值。空白中不含有 1，10-邻菲罗啉一水化物及(NH4)2Fe(SO4)2。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 心肌细胞的组织学形态

组织形态学研究表明，空白组心肌细胞排列整齐，无炎症细胞侵润;损伤组中，镉毒性能够引起心肌细胞小灶状坏死，产生空泡及炎症细胞的侵润，此外，观察到心肌细胞肿胀;然而在CAPE保护组，C组中，仍有心肌细胞坏死及大量的空泡结构，而D组空泡形成减少、心肌细胞基本正常，E组心肌细胞结构完整，无炎症细胞的侵润等，结果表明镉对心脏的毒性损伤及CAPE的保护作用。

图1 镉对心脏NO含量的影响以及CAPE的保护作用Fig.1 The influence of cadmium on cardiac NO content and the protective effect of CAPE

图2 不同浓度CAPE的金属螯合能力Fig.2 Metal chelating capacities of different concentrations of CAPE

2.2 各组NO含量及CAPE的金属螯合能力比较

通过测定镉损伤组及CAPE保护组NO含量，发现镉毒性能够降低NO水平，为正常组的87.1%(P ＜0.05)，而CAPE的保护作用能够抑制NO的减低(P ＜ 0.05)(图1)。

如图2所示，CAPE的金属螯合数据表明CAPE可以呈浓度依赖螯合Fe2+，具有金属螯合作用。

3 讨论

镉致心脏损伤的发病机制与其影响因素有关。研究表明镉毒性作用能够诱导氧化应激，导致脂质过氧化反应(Lipid Peroxidation，LPO)的增加;镉还能够通过减少一氧化氮(NO)的释放诱导血管内皮细胞的损伤［5］;此外，炎症反应也是心脏损伤的关键诱因［6］。

CAPE是中药蜂胶的主要活性成分，具有广泛的生理药理活性，包括抗氧化、抗病毒、抗动脉硬化、抗菌、抗炎、诱导细胞凋亡和提高机体免疫力等［7］。我们之前的研究显示，CAPE对镉致心脏损伤具有保护作用，其机制可能与CAPE的抗氧化作用有关。本研究从组织病理学角度观察了镉致心脏损伤形态学的改变及CAPE的保护作用。空白组心肌细胞排列整齐，无炎症浸润;损伤组产生空泡，心肌细胞发生肿胀;而CAPE能够明显抑制镉对心肌细胞造成的损伤。说明镉毒性能够对心肌细胞造成损伤，破坏正常的细胞形态，影响功能，然而CAPE的保护作用能够缓解损伤，减少镉的毒害，与文献报道一致［8］。

NO可能是自由基毒性的保护因子，氧自由基通过下调NO的合成，从而损伤心脏功能，因此镉的心脏毒性可能与心脏组织中NO含量的减少有关。CAPE能够提高心脏组织中NO的含量，可能的途径有直接增加NOS的活性、激活某些酶协同因子的产生或通过清除自由基，阻止自由基对NO产生的抑制作用［9］。通过测量NO的含量，从另一方面探讨了CAPE对镉诱导心脏损伤的保护机理。

镉致心脏损伤的毒性机制还可能和镉与生物大分子的结合有关，进而导致关键酶的失活或者引起DNA链的断裂，形成恶性循环［3］。CAPE呈浓度依赖的螯合Fe2+，证明CAPE具有较强的金属螯合能力。因此，CAPE能够保护心脏免受镉损伤可能是通过螯合体内游离的镉离子，减弱镉对生物大分子的损伤，起到类似于金属硫蛋白的作用。CAPE的金属螯合能力主要与其分子结构有关。CAPE双键共轭的苯环上3，4位各有一个酚羟基，相邻的酚羟基能以氧负离子的形式与金属离子形成稳定的五元环螯合物，从而发生络合反应［10］。本研究从另一方面阐明了CAPE对镉致心脏损伤的保护机理，也为重金属的解毒提供了新思路，对CAPE药物开发提供了理论依据和数据支持。

综上所述，镉通过抑制NO的释放，改变小鼠心肌细胞的正常形态，损伤其正常机能;CAPE对镉致心脏损伤的保护途径可能是通过螯合金属离子，减弱其对生物大分子的损伤，起到类似于金属硫蛋白的作用。

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