β-环糊精包合挥发油和丹皮酚的工艺研究

谷 雨，潘书洋，李超生，王 晶，于蔷蔷，李 喆，华 山

1吉林农业大学，长春 130118;2吉林省食品药品检验所，长春 130033;3吉林省中医药科学院，长春 130012;4延边大学，延吉 133000

益气补肾活血胶囊是治疗认知功能障碍的复方新药，处方是由“人参、石菖蒲、牡丹皮、三七”等七味药组成。目前中医学者们将认知功能障碍归属于“健忘”、“善忘”的范畴。当前研究表明，认为轻度认知障碍与以往研究者对老年痴呆病因病机的认识相似，本病以脏腑虚衰、肾心亏虚为本，痰浊血瘀为标。有众多学者采用补肾益心、健脾益气、祛痰活血通络等方药及针刺治疗［1］，本处方也是针对这几方面进行治疗。根据文献报道［2，3］，石菖蒲中的挥发油和牡丹皮中的丹皮酚对认知功能障碍有治疗作用，是治疗的有效部位或有效成分。临床广泛用于癫病、痰厥、热病神昏、健忘、中风失语、耳鸣、老年性痴呆等疑难病症［4］。

石菖蒲挥发油和丹皮酚易挥发，常规的水煎工艺会导致其损失，为了更好地发挥其药效作用，本实验将处方中石菖蒲提取挥发油的工艺和牡丹皮提取丹皮酚的工艺进行优选，在此基础上，对所得到的石菖蒲挥发油和丹皮酚用环糊精包合，本实验在考察包合方法时，以挥发油的利用率为考察指标进行考察，在选择的包合方法基础上，考虑处方中的丹皮酚也容易挥发，易造成药品质量的下降，所以把丹皮酚也与石菖蒲挥发油一起包合。因为挥发油的成分比较复杂，不容易检测，而丹皮酚的含量相对可控，所以在考察包合工艺时选用液相法测包合物中丹皮酚的含量，得到最佳的包合工艺，保证药材的合理应用和药品的质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC-10AT高效液相色谱仪，SPD-10Avp紫外检测器;CX-250超声波清洁器(北京医疗设备二厂);FA604A型电子天平(上海精天电子仪器有限公司);101A-1ET电热鼓风干燥箱。

1.2 试药

挥发油、丹皮酚(自制);β-环糊精，上海惠世生化试剂有限公司;无水乙醇，北京化工厂;丹皮酚对照品购自中国药品生物制品检定所，批号:110708-200505;甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 包合方法的比较［5，6］

根据相关文献，对研磨法和水饱和溶液法两种包合方法进行比较。

2.1.1 水饱和溶液法

称取β-环糊精6.0017 g，置于磨口锥形瓶中，加蒸馏水制成饱和溶液利用磁力搅拌器搅拌，温度为35℃，用胶头滴管逐滴加入挥发油乙醇溶液1 mL，搅拌1 h后将所得产物冷藏过夜，次日抽滤，先用水洗涤3次，每次10 mL，再用无水乙醇洗涤数次，多次少量共约7 mL，放入40℃烘箱4 h，即得终产物。

2.1.2 研磨法

称 β-环糊精6.0016 g，置于研钵中，加入20 mL蒸馏水，沿同一方向研磨均匀，使溶液成糊状，用胶头滴管逐滴加入挥发油乙醇溶液1 mL，研磨1 h，再置于冰箱冷藏过夜。次日抽滤，洗涤，先用30 mL水多次少量冲洗，再用无水乙醇7 mL冲洗，产物于烘箱40℃干燥4 h，即得终产物。

2.1.3 包合物中挥发油含油率及油利用率

按照药典挥发油测定法第二法测定，将所得干燥包合物精密称重，利用挥发油提取器提取5 h，至油量不再增加时停止加热，充分静置读数，计算包合物中挥发油含油量及油利用率，公式如下:

表1 包合方法比较Table 1 Comparison of inclusion methods

从表1可知，研磨法含油量为0.71 mL，水饱和溶液法含油量为0.39 mL，表明研磨法制备石菖蒲挥发油β-环糊精包合物，其挥发油利用率较高，故后续试验采用研磨法。

2.2 包合物的制备

按照正交试验表，称取规定量的β-环糊精，加规定体积水研磨，再加入规定量以无水乙醇稀释的挥发油(0.5 mL)和丹皮酚(0.4 g)，共同研磨至规定时间，放入4℃冰箱冷藏过夜，次日过滤，加规定体积无水乙醇，洗涤包合物，包合物低温(40℃)烘干，放置备用。

2.3 丹皮酚含量测定

2.3.1 色谱分析条件

仪器型号:岛津LC-10AT高效液相色谱仪;色谱柱为 Diamonsil C18(250 mm × 4.5 mm，5 μm);检测波长:274 nm;流速:1.0 mL/min;柱温为室温;流动相:50%甲醇。

2.3.2 对照品溶液制备

精密称取丹皮酚对照品5.76 mg，置于100 mL容量瓶中，加甲醇定容。

2.3.3 供试品溶液制备

取适量的包合物，置于50 mL容量瓶中，加入30 mL甲醇超声30 min，放冷后用甲醇定容。过滤，收集续滤液，即得。

2.3.4 标准曲线制备

精密量取对照品溶液 2、4、8、10、16 μL，分别进样。按“2.3.1”项下色谱条件测定，测得丹皮酚峰面积。以对照品量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，经回归处理，得回归方程为:Y=134750X-15695，相关系数 r=0.9995。结果表明丹皮酚在0.115～0.922 μg范围内，峰面积与样品量有良好的线性关系。

2.3.5 精密度试验

精密吸同一供试液，按“2.3.1”项下色谱谱条件，连续进样6次，每次10 μL。测得丹皮酚平均峰面为2284514.04，计算其 RSD 为1.33%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.3.6 稳定性试验

精密吸同一供试品溶液，分别于制备后0、2、4、6、12、24 h，按“2.3.1”项下的色谱条件，各进样 10 μL，测得丹皮酚平均峰面积为2115559.00，计算其RSD为0.76%(n=6)，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.3.7 重复性试验

精密称取同一批包合物，共取5份，各约0.08 g，按供试品溶液的配制方法制备样品，按“2.3.1”色谱条件进行测定，每次进样10 μL，测得丹皮酚的平均含量为4.97%(n=5)，RSD 为1.98%，表明该方法具有较好的重复性。

2.3.8 回收率试验

取同一批包合样品(包合物中丹皮酚含量为4.966%)约0.04 g，精密称定5份，分别精密加入丹皮酚对照品约2.5 mg，按照方法制备供试品溶液，按色谱条件进行测定，每次进样10 μL，测得丹皮酚平均回收率为99.67%，RSD为0.85%。

表2 回收率实验结果Table 2 Recovery test results

2.4 β-环糊精包合挥发油和丹皮酚预实验

2.4.1 β-环糊精包合挥发油和丹皮酚用量比对包合工艺的影响

分别称取β-环糊精4 g(β-环糊精∶丹皮酚∶挥发油 =4∶0.4∶0.5)、8 g(β-环糊精∶丹皮酚∶挥发油 =8∶0.4∶0.5)、10g(β-环糊精∶丹皮酚∶挥发油 =10∶0.4∶0.5)三份，每份加入3倍量的水，沿同一方向研磨均匀，使溶液成糊状，用胶头滴管逐滴加入挥发油、丹皮酚乙醇溶液，研磨1.5 h，再置于冰箱冷藏过夜。次日抽滤，先用30 mL水多次少量冲洗，再用无水乙醇5 mL冲洗，产物于烘箱40℃干燥4 h，将制得的包合物依法测定其包合率。结果如图1，随着β-环糊精与挥发油和丹皮酚比例的增加，包合率呈现增长趋势，当β-环糊精达到8g时，饱和率达到最大，因此选用 4、6、8 g β-环糊精进行正交试验。

图1 β-环糊精包合挥发油和丹皮酚用量比对包合工艺的影响Fig.1 Effect of amount of β-cyclodextrin on inclusion rate

2.4.2 加水量与β-环糊精用量比对包合工艺的影响

称取β-环糊精三份，每份8 g，分别加入2倍、3倍、4倍水，其余操作同2.4.1项，制得的包合物测定其包合率。结果如图2，在加入3倍量水时，包合率达到最大，加2倍水时，不能充分使β-环糊精搅拌均匀。因此选用3倍、4倍、5倍加水量进行正交试验。

图2 加水量与β-环糊精用量比对包合工艺的影响Fig.2 Effect of ratio of water/β-cyclodextrin on inclusion rate

2.4.3 研磨时间对包合工艺的影响

称取β-环糊精三份，每份8 g，分别加入3倍量水，沿同一方向研磨均匀，使溶液成糊状，用胶头滴管逐滴加入挥发油、丹皮酚乙醇溶液，研磨0.5、1、1.5 h，其余操作同 2.4.1项，制得的包合物测定其包合率。结果如图3，研磨时间越长其包合效果越好，因此正交试验中选用1、1.5、2 h三个水平。

图3 研磨时间对包合工艺的影响Fig.3 Effect of grinding time on inclusion rate

2.4.4 无水乙醇冲洗量对包合工艺的影响

在实验过程中发现，无水乙醇冲洗量对丹皮酚的包合率也有影响，因此，将无水乙醇冲洗量也作为考察因素。称取β-环糊精8 g，每份加入3倍量的水，沿同一方向研磨均匀，使溶液成糊状，用胶头滴管逐滴加入挥发油、丹皮酚乙醇溶液，研磨1.5 h，再置于冰箱冷藏过夜。次日抽滤，先用30 mL水多次少量冲洗，再用5、10、15 mL无水乙醇冲洗，产物于烘箱40℃干燥4 h，将制得的包合物依法测定其包合率。结果如图4，5 mL无水乙醇冲洗包合率最高，增加无水乙醇用量，包合率减少，小于5 mL时，无水乙醇无法将包合物全部覆盖。

2.5 正交试验提取因素与水平设计方案

图4 无水乙醇冲洗量对包合工艺的影响Fig.4 Effect of volume of washing anhydrous ethanol on the inclusion rate

根据预实验结果，以丹皮酚的包合率为指标，选择β-环糊精、丹皮酚和挥发油比例、加水量、研磨时间无水乙醇冲洗量作为考察因素。用L9(34)正交表进行试验设计优选，测定出包合物中丹皮酚的含量，计算丹皮酚的包合率。其因素和水平见表3，实验结果见表4，方差分析见表5。

表3 包合工艺考察因素及水平Table 3 The factor-level table of orthogonal design

按正交表L9(34)正交表进行安排试验，每次试 验均重复1次。

表4 包合工艺L9(34)正交实验结果Table 4 Orthogonal design and results of inclusion procedure

表5 包合工艺方差分析Table 5 Variance analysis of inclusion procedure

通过方差分析表可以看出，A和D均具有显著性，并且 A3＞A2＞A1，B1＞B2＞B3，C3＞C2＞C1，D1＞D2＞D3，最佳工艺为 A3B1C3D1即 β-环糊精∶丹皮酚(0.4g)∶挥发油(0.5 mL)=8∶0.4∶0.5 加入 3 倍β-环糊精量的水研磨，研磨2 h，用5 mL(0.5 mL挥发油，0.4 g丹皮酚时)无水乙醇冲洗。

2.6 验证实验

为进一步考察优化工艺的可靠性，按上述最佳提取工艺进行验证试验，制成3份包合物，测定其丹皮酚包合率，方法同上。包合率依次为88.36%、88.61%、88.90%。检验结果与上述最佳工艺无显著差异，平均包合率为88.62%，高于正交表上的包合率，故最佳工艺为A3B1C3D1即β-环糊精∶丹皮酚(0.4 g)∶挥发油(0.5 mL)=8∶0.4∶0.5，加入 3 倍β-环糊精量的水研磨，研磨2 h，用5 mL(0.5 mL挥发油，0.4 g丹皮酚时)无水乙醇冲洗。

2.7 β-环糊精包合挥发油和丹皮酚稳定性试验

制作三批β-环糊精包合挥发油和丹皮酚包合物(于室温下留样观察)，以丹皮酚包合率为考察指标，当月考察一次，以后每月考察一次，连续考察三个月后，于六个月再分别进行考察，每次每份取约0.1 g，定容至50 mL 容量瓶中，按“2.3.1”项下的色谱条件，各进样10 μL，测得三批包合物平均包合率分别为 87.20%、88.14%、88.32%，RSD 值分别为0.55%、0.17%、0.38%，结果表明包合物在 6 个月内基本稳定。

2.8 β-环糊精包合挥发油和丹皮酚均一性试验

取第三批β-环糊精包合挥发油和丹皮酚包合物，从中随机抽取十份，每份取约0.1 g，定容至50 mL容量瓶中，按“2.3.1”项下的色谱条件，各进样10 μL，测得丹皮酚的平均饱和率为 87.91%(n=10)，RSD为1.27%，表明该包合物均一性良好。

2.9 包合物含水量测定

按《中国药典》(2010年版一部)附录IX H水分测定法第二法测定，精密称定供试品包合物14.9121 g，置于500 mL短颈圆底烧瓶中，加甲苯约200 mL，加入干燥、洁净的沸石，将仪器各部分连接，将圆底烧瓶缓缓加热，待甲苯开始沸腾时，调节温度，使每秒钟馏出2滴。待水分完全馏出后，即测定管刻度部分的水量不再增加时，将冷凝管内部先用甲苯冲洗，再用饱蘸甲苯的长刷将管壁上附着的甲苯推下，继续蒸馏5 min，放冷至室温，拆卸装置，放置，使水和甲苯完全分离。检读水量，并计算供试品中的含水量(%)。公式如下:

经计算，该包合物含水量=1.3 mL×1 g/mc3/14.9121 g×100%=8.72%，符合国家药典规定。

3 讨论

石菖蒲中主要成分为挥发油，牡丹皮中主要成分为丹皮酚，两者在中国药典2010年版一部收载的该药材标准中都是含量测定部分，挥发油有镇静，促进学习记忆和抗痴呆作用;丹皮酚具有免疫调节功能，对治疗老年痴呆有重要作用，因此，挥发油和丹皮酚的包合工艺研究具有实际应用意义。

丹皮酚在高温是易挥发，在热水中溶解的特性;石菖蒲挥发油为止痛的有效成分，性质不稳定，从而降低疗效。根据处方中牡丹皮的含量和用量，处方中共含有丹皮酚0.4 g，我们将丹皮酚和石菖蒲挥发油同时包合在β-环糊精中，从而提高丹皮酚和挥发油的利用率，增强药效。

通过正交设计对石菖蒲挥发油和丹皮酚的包合工艺进行了优化，并按最佳工艺进行了验证实验，正交实验结果的方差分析表明，β-环糊精∶丹皮酚(0.4 g)∶挥发油(0.5 mL)的比值和用无水乙醇冲洗量对包合的结果有显著性影响，加水量、研磨时间对包合没有太大的影响。验证实验结果与正交表中的最优水平一致，说明实验确定的工艺合理。

1 Fu S(富苏)，Zhang MR(张孟仁).中医药对轻度认知功能障碍的研究进展.J Liaoning Univ TCM(辽宁中医药大学学报)，2009，11(4):57-59.

2 Wang B(王斌)，Ge ZD(葛志东)，Zhou AW(周爱武)，et al.Effects of total glucosides of mudan cortex on functions of three types of immune cells in vitro.Chin Pharm Bull(中国药理学通报)，1999，15:63-65.

3 Zhang LH(章灵华)，Xiao PG(肖培根)，Huang Y(黄艺)，et al.丹皮酚的药理与临床研究进展.Chin J Integr Tradit West Med(中国中西药结合杂志)，1996，16(3):187.

4 Li G(李刚)，Zeng XF(曾祥发)，Lu H(陆晖)，et al.石菖蒲健脑益智作用的研究进展，J Guangxi Tradit Chin Med Univ(广西中医学院学报)，2009:74-76.

5 Zhou YX(周燕霞)，Tang ML(唐明林)，Yin HA(殷辉安)，et al.The preparation of Yinchenand Baishu volatile oilβ-cydodextrin complex.Guangzhou Chem(广州化学)，2006，31(3):20-23.

6 Yan YP(严玉平)，Li CH(李春花)，Song XY(宋晓宇)，et al.Research of inclusion technology for volatile oil of Biyuanling granule by rubbing.Mod Chin Med(中国现代中药)，2007，9(8):25-27.