海洋链孢囊菌FIM09-1157产生的神经氨酸酶抑制剂

彭 飞，王传喜，江宏磊，江宁宇，谢 阳，陈路劼，江 红，连云阳

福建省微生物研究所，福建省新药(微生物)筛选重点实验室，福州 350007

放线菌是生物活性物质的重要来源，随着从链霉菌(Streptomyces sp.)中发现新活性物质概率的降低，稀有放线菌［1］逐步成为关注的热点，如Nocardia、Micromonospora、Microbispora、Saccharothrix、Streptosporangium 等［2，3］。链孢囊属(Streptosporangium)放线菌作为一类稀有放线菌，其产生的许多次级代谢产物因具有抗菌、抗肿瘤等广泛的生物学活性而备受关注，如 platomycins［4］、sibiromycin［5］、sinefungin［6］。

本实验室从海洋沉积物中分离筛选出一株放线菌FIM09-1157，其发酵代谢产物具有抑制神经氨酸酶活性。本文采用形态学描述和16S rDNA序列分析对该菌株进行初步分类学研究，同时利用各种化学分离技术从放线菌FIM 09-1157发酵液中获得活性代谢产物T1并进行结构解析，研究其体外神经氨酸酶抑制活性。

2 材料和方法

2.1 仪器与材料

AV-400核磁共振仪(美国Bruker公司)，TMS为内标;质谱仪(Aligent Quattro Premier Triple Quadrupole mass spectrometer);高效液相色谱仪(SHIMADZU 20A-DAD);Agilent ultimate XB-C18色谱柱(10 × 250 mm，5 μm);Sephadex LH-20(Pharmacia公司);柱色谱硅胶(200～300目)和硅胶H及薄层色谱硅胶GF254(青岛海洋化工厂);神经氨酸酶抑制剂筛选试剂盒(碧云天生物技术研究所)。

2.2 菌种来源

FIM09-1157来自于福建省微生物研究所菌种保藏中心，从台湾海峡的海泥样品中分离得到，其发酵代谢产物具有神经氨酸酶抑制活性。

2.3 菌株FIM 09-1157分类学研究

形态观察:菌株FIM09-1157的孢子悬液在高氏-天冬素琼脂平板上划线，同时斜插无菌盖玻片，35℃培养，分别于5、10、20天取出盖玻片，在光学显微镜及电镜下观察菌丝及孢子形态特征。

16S rDNA序列分析:菌株总DNA提取采用刘志恒等人的方法［7］。以总DNA为模板，引物序列如下:27f:5'-agagtttgatcctggctcag-3';1492r:5'-tacggctaccttgttacgactt-3'，Tag酶进行PCR扩增。扩增程序采用:94℃预变性2 min，94℃变性40 s，54℃退火40 s，72℃延伸3 min，共30个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物的测序由北京泰京生物有限公司完成。测序结果在NCBI进行BLAST比对，再通过软件Clustalx(version 1.8)对扩增序列和GenBank中近缘典型菌种的序列进行比对，用MEGA4.1构建系统发育树。

2.4 培养基和发酵培养条件

斜面培养基采用含1%NaCl的ISP-3，成熟的培养物从斜面培养基中接入种子培养基:可溶性淀粉15 g;葡萄糖5 g;蛋白胨5 g;酵母粉5 g;K2HPO40.5 g;MgSO4·7H2O 0.5 g;CaCO31 g;NaCl 0.5 g;(NH4)2SO40.5 g;H2O 1000mL;pH7.5;28℃ 220 rpm培养72 h，以8%接种量转接发酵培养基:可溶性淀粉40 g;葡萄糖5 g;黄豆饼粉20 g;蛋白胨5 g;燕麦 5g;NaCl 0.5 g;MgSO4·7H2O 0.5 g;K2HPO40.5 g;CaCO31 g;H2O 1000 mL;pH7.5;28 ℃ 220 rpm培养120 h。

2.5 分离纯化方法

放线菌FIM09-1157发酵液40 L，4500 rpm离心15 min得上清液。菌丝体用3倍体积的甲醇浸泡2 h，离心后用水稀释成20%的甲醇浸泡液，上述两部分合并经大孔吸附树脂HP-20吸附，甲醇洗脱，洗脱液减压浓缩蒸干，加入适量的乙酸乙酯溶解提取3次，合并乙酸乙酯溶液，蒸干得粗品。

粗品用甲醇溶解后硅胶拌样，上硅胶柱，氯仿-甲醇梯度洗脱，神经氨酸酶活性检测跟踪，TLC分析合并相同活性馏份，浓缩后采用Sephadex LH-20凝胶分离，氯仿:甲醇(1∶1)洗脱，活性与TLC跟踪，活性馏份进一步经反相C18色谱柱层析(5% ～100%甲醇-水梯度洗脱)和半制备HPLC(ultimate XB-C18，5 μm，10 ×250 mm，甲醇:1‰氨水 =1∶4，238 nm)纯化，得到化合物 T1(40mg，tR=25 min)。

2.6 抑制神经氨酸酶活性测试方法

采用96孔荧光酶标板测定，每孔依次加入70 μL神经氨酸酶检测缓冲液，10 μL神经氨酸酶(0.3 U/mL)，5 μL待测样品(对照孔以缓冲液代替)和5 μLMilli-Q水。振动混匀1 min，37℃孵育2 min，每孔再加入10 μL神经氨酸酶特异性荧光标记底物(80 mmol/L)，振动混匀1 min，37℃孵育20 min后用M5多功能酶标仪(美国Molecular Devices公司)测定荧光强度(F)。激发波长为360 nm，检测波长为440 nm。

计算样品对神经氨酸酶的抑制率和半数抑制浓度。公式:抑制率(%)=(F对照-F样品)/F对照×100%。

3 结果与分析

3.1 菌株FIM09-1157分类学研究

菌株FIM09-1157接种在含1%NaCl的燕麦琼脂上，28℃培养20 d后，菌落呈圆形，直径约1～3 cm，边缘整齐，菌落隆起，表面稍皱折，菌落表面被一层粉红色粉状的孢子层覆盖，基丝的颜色为深粉红色(Deep Pink)，菌落周围未见可溶性色素产生。基丝生长丰富，分枝较少，无横隔，不断裂，气丝上有孢囊形成，孢囊圆形，直径5 ～8 μm(图1)。

图1 菌株FIM09-1157扫描电镜菌丝形态(ISP9+蜜二糖琼脂28℃培养30 d)Fig.1 Scanning electron micrograph of strain FIM 09-1157 grown on ISP9+melibiose at 28 °C for 30 days.(Bar，10 μm)

测得菌株FIM 09-1157的16S rDNA序列1415 bp(Accession number:JQ910638)与 Genebank中基因序列进行Blast比对，结果发现该菌与Streptosporangiumvulgarestrain ATCC 33329同源性最高，达到99%。采用Neighbor-Jointing法构建FIM 09-1157与近缘典型菌株的16S rDNA系统进化树(图2)。菌株FIM 09-1157 与链孢囊菌 S.vulgarestrain ATCC 33329、S.purpuratum strain CY-15110 以及 S.yunnanense strain CY-11007处于同一个分枝。16S rDNA序列分析表明菌株FIM 09-1157属于链孢囊菌(Streptosporangium)，暂定名 为StreptosporangiumFIM 09-1157。

图2 FIM09-1157与相关典型菌株的16S rRNA系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree based on the16S rDNA sequences of strain FIM09-1157 and representative species of the genus Streptosporangium(Bootstrap values are shown as percentages at each node)

3.2 化合物T1的结构鉴定

化合物T1为白色粉末。其甲醇溶液在239 nm和302 nm处有特征UV吸收。ESI-MS:m/z 239［M+H］+，1H-NMR，13C-NMR，1H-1H COSY 以及 HMBC数据如表1所示。综合分析化合物T1紫外、质谱及核磁等光谱学数据，结合文献［8］，确定化合物T1为硫内酯类化合物Thiotetromycin。化学结构见图3。

表1 T1的核磁共振数据表Table 1 The NMR spectral data of compound T1

图3 化合物T1的结构Fig.3 Chemical structure of compound T1

3.3 活性结果

活性筛选发现化合物T1体外具有抑制神经氨酸酶活性，其半抑制浓度 IC50值为92 μmol/L，而神经氨酸酶抑制剂扎那米韦［11］的半抑制浓度IC50值为246.3 μmol/L。当浓度达到210 μmol/L 时，化合物T1对神经氨酸酶的抑制率达到96%。

4 讨论

已发现链孢囊菌(Streptosporangium sp.)能够产生许多结构新颖的活性代谢产物，如Spoxazomicins［9］。本文首次从链孢囊菌(Streptosporangium sp.)代谢产物中筛选到硫内酯类抗生素Thiotetromycin，进一步说明了链孢囊菌产生次级代谢产物的多样性。

抗生素Thiotetromycin［8］是1983年日本科学家从链霉菌(Streptomyces sp.)的发酵液中分离得到。结构研究发现化合物T1与Thiotetromycin同质，与另一个具有共轭二烯以及5元硫内酯环结构的化合物Thiolactomycin［10］结构相似，两者仅在内酯环侧链基团上有微小差异(前者为乙基，而后者的侧链基团是甲基)。本文首次报道Thiotetromycin具有神经氨酸酶抑制活性，其活性强于目前临床使用的神经氨酸酶抑制剂扎那米韦，说明此类物质可能具有潜在的抗病毒活性。本项研究发现了硫内酯类化合物新的生物学活性，为从硫内酯类化合物中发现结构新颖的神经氨酸酶抑制剂奠定基础。

1 Lazzarini A，Cavaletti L，Toppo G，et al.Rare genera of actinomycetes as potential producers of new antibiotics.Antonie Van Leeuwenhoek，2001，78:399-405.

2 Sanglier JJ，Haag H，Huck TA，et al.Review of actinomycetes compounds 1990-1995.Exp Opin Invest Drugs，1996，5:207-223.

3 Lamari L，Zitouni A，Boudjella H，et al.New dithiolopyrrolone antibiotics from Saccharothrix sp.SA 233.I.Taxonomy，fermentation，isolation and biological activities.J Antibiot(Tokyo)，2002，55:696-701.

4 Takazawa S，Kawamoto I，Takahashi I，et al.Platomycins A and B.taxonomy of the producing strain and production，isolation and biological properties of platomycins.J Antibiot(Tokyo)，1975，28:656-661.

5 Hurley LH，Lasswell WL，Malhotra RK，et al.Pyrrolo［1，4］benzodiazepine antibiotics.biosynthesis of the antitumor antibiotic sibiromycin by Streptosporangiumsibiricum.Biochemistry，1979，18:4225-4229.

6 Cooper R，Das P，Federbush C，et al.Characterization of peptidyl-nucleoside antifungalantibiotics from fermentation broth.J Ind Microbiol，1990，5:1-8.

7 Liu ZH(刘志恒)，Jiang CL(姜成林).Modern biology and biotechnology of actinomycete(放线菌现代生物学与生物技术).Beijing:Science Press，2004.293-295.

8 Omura S，Nakagawa A，Iwata R，et al.Structure of a new antibacterial antibiotic，thiotetromycin.J Antibiot(Tokyo)，1983，36:1781-1782.

9 Inahashi Y，Iwatsuki M，Ishiyama A，et al.Spoxazomicins AC，novel antitrypanosomal alkaloids produced by an endophyticactinomycete，Streptosporangiumoxazolinicum K07-0460(T).J Antibiot(Tokyo)，2011，64:303-307.

10 Sasaki H，Oishi H，Hayashi T，et al.Thiolactomycin，a new antibiotic.II.Structure elucidation.J Antibiot(Tokyo)，1982，35:396-400.

11 Zhang F(张博)，Fu J(付杰)，Zhou YD(周永达)，et al.Researches on influenza neuraminidase inhibitors.Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开发)，2009，21:253-257.