眼针疗法对D-IBS模型大鼠结肠VIPR1表达的影响

王德山 王艳杰 刘慧慧 刘旭东 柴继严 赵金茹 (辽宁中医药大学基础医学院，辽宁 沈阳 0032)

由我国著名针灸学家彭静山教授创立的眼针疗法，在防治肠易激综合征等胃肠道功能性疾病方面疗效显著，但是其作用机制目前尚不清楚。本实验观察了眼针对腹泻型肠易激综合征(D-IBS)大鼠模型血清、结肠组织VIP含量及VIP-R1的表达影响，为眼针防治D-IBS作用机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物分组 SPF级雄性Wistar大鼠30只，体重(220±20)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证编号:SCXK(京)2007-0001。分笼饲养，标准颗粒饲料喂养7 d以后按随机数字法分为:对照组、模型组和眼针组，每组10只。

1.2 IBS模型建立与评价指标 在 Katz和 Williams等〔1，2〕方法基础上，采用慢性应激刺激与束缚结合方法建立D-IBS模型〔3〕。IBS成模评价指标:①依据一般状态、排便粒数与结肠转运功能;②大鼠的腹部回缩反射(CRD)半定量评分;③结肠组织形态学观察。

1.3 眼针刺激方法 通过D-IBS评价标准确定模型复制成功后，眼针组给予眼针刺激，取穴参照人体取穴定位法分别取:下焦区、大肠区、肝区、脾区〔3〕;刺法:用31号13 mm毫针，于大鼠眶周2 mm处针刺;手法:平刺，进针3 mm，留针20 min。每12 h刺激1次，连续针刺7 d。模型组只进行束缚处理，对照组不给予刺激。

1.4 结肠转运功能测定 造模的第18天和眼针治疗后，大鼠禁食24 h，以30%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔麻醉，用胶带束缚大鼠前肢，取直径为3 mm的玻璃小球放入距肛门3 cm的直肠内。大鼠苏醒后迅速移至笼内喂食饮水，笼内铺垫清洁滤纸。观察1 h内大鼠排便的粪点数和玻璃小球排出时间。

1.5 内脏敏感性评估 采用腹部回缩反射(AWR)测定法。实验前禁食12 h，乙醚麻醉状态下将带有球囊的导尿管置入距肛门内1 cm处并固定于尾部，将大鼠限制在特制的透明塑料笼(20 cm×6 cm×8 cm)内，只能前后运动而不能转身。清醒30 min后向球囊内分别注入容量为1.0、1.5、2.0 ml温水扩张结、直肠 (CRD)，每一容量扩张持续时间为20 s，间隔30 s;重复3次。根据腹部回缩反射评分标准进行AWR评分，取3次评分的平均值。分值越高为内脏敏感性越强。

大鼠AWR评分标准〔4〕:0分:大鼠对结肠扩张时无行为反应;1分:结肠扩张时身体静止不动，头部运动减少;2分:结肠扩张时腹肌收缩但未抬离桌面;3分:结肠扩张时腹肌收缩并抬离桌面;4分:结肠扩张时骨盆抬起，身体呈弓状。

1.6 结肠组织病理学观察 手术取距肛门上10 cm处取结肠全层组织，常规用HE染色，光镜观察组织病理学变化。

1.7 血清和结肠组织中VIP含量的测定 眼针结束后，麻醉后腹主动脉取血3 ml，分离血清供检测用;取盲肠上结肠组织，清理干净后按1∶9加入预冷生理盐水制备匀浆，离心取上清，按照试剂盒说明书进行ELISA检测。利用全自动酶标仪，在450 nm处测定各孔的OD值，采用Curve Expert 1.3进行标准曲线的绘制，并计算出对应的浓度值。

1.8 结肠组织中VIP-R1的mRNA与蛋白表达检测 Trizol及RT-PCR试剂盒、引物由大连宝生物工程提供。VIP-R1基因表达采用二步法进行RT和PCR操作，利用Trizol试剂进行总RNA的提取，以紫外分光光度计测量吸光度，记录OD260及OD280值，二者比值即为总RNA纯度。取OD260/OD280在1.8～2.0之间的RNA按照RT试剂盒要求逆转录合成cDNA，取5 μl逆转录产物作为模板在25 μl体系中进行PCR扩增。反应条件为 94℃预变性 2 min;94℃30 s，65℃30 s，72℃30 s，共 30 个循环;72℃延伸5 min。扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后，利用凝胶成像分析系统进行扫描和分析扩增带，与内参β-actin比较，得到VIP-R1 mRNA的相对表达强度。参照SABC试剂盒说明书进行免疫组化法检测结肠组织中VIP-R1蛋白表达。应用BI-2000图像分析系统，随机选取每张切片的3～5个视野，×200光镜下测定阳性细胞的平均光密度值，平均光密度值代表阳性表达参数，平均光密度值越大，阳性表达越强。

2 结果

2.1 眼针对D-IBS模型大鼠一般状态的影响 在本实验过程中无动物死亡。与对照组比较，模型制备过程中大鼠毛色渐晦暗、进食和活动减少，体形消瘦;表现极度烦躁，出现躲避、畏惧、嘶叫、互相对峙、甚至扭打撕咬等易激惹表现;排便次数明显增多，便质变软变稀，粪点不成型;排出玻璃小球时间明显缩短;大鼠AWR评分均明显增高;显微镜下大鼠结肠组织各层无白细胞浸润，间质有水肿。根据成模标准D-IBS大鼠模型复制成功。经过眼针治疗后，与模型组比较，眼针组大鼠表现为活泼好动，毛发光泽，体重增加，激惹及轻度好斗倾向缓解。小球排出时间延长，排便次数和大便粒数明显减少而成型、便质逐渐恢复正常(图1)。

AWR用于检测大鼠内脏敏感性实验，其结果如图2所示，与对照组比较，模型组大鼠在1.0、1.5、2.0容量扩张下AWR评分均显著升高(P＜0.05);与模型组比较，眼针组AWR评分则明显降低(P＜0.05)，表明眼针能够降低D-IBS模型大鼠内脏敏感性。

2.2 眼针对D-IBS模型大鼠血清及结肠组织中VIP含量的影响 如表1所示，各组血清中VIP含量变化均高于结肠组织值。与对照组比较，模型组和眼针组大鼠血清VIP水平均升高(P＜0.01)，尤以模型组升高显著(P＜0.01);眼针组的结肠组织中VIP含量明显低于模型组(P＜0.05)，与对照组没有显著性差异(P＞0.05)。

图1 眼针对D-IBS模型大鼠排便颗粒数的影响

图2 眼针对D-IBS模型大鼠AWR评分的影响

表1 眼针对D-IBS模型大鼠血清及结肠组织VIP含量的影响(n=10，±s，ng/L)

表1 眼针对D-IBS模型大鼠血清及结肠组织VIP含量的影响(n=10，±s，ng/L)

与对照组比较:1)P＜0.01;与模型组比较:2)P＜0.05

组别 血清 结肠组织对照组3.09±1.65 2.812±0.112模型组 10.46±3.331) 4.258±0.3111)眼针组 5.63±2.331)2) 2.902±0.2351)2)

2.3 眼针对D-IBS大鼠模型结肠组织中VIP-R1表达的影响

应用免疫组化方法检测观察到，上皮组织由吸收细胞和杯状细胞组成，VIP-R1蛋白阳性物表达部位主要在结肠黏膜上皮组织中，呈棕黄色反应(图3)。与对照组比较，模型组大鼠结肠组织VIP-R1阳性反应呈现出密集的表达，与模型组(0.351±0.024)比较，眼针组 VIP1-R阳性表达(0.265±0.010)均显著降低(P＜0.05)，与对照组(0.232±0.012)比较差异显著(P＜0.01)。结肠组织中VIP-R1 mRNA表达检测结果如图4所示，与对照组(0.742±0.130)比较，模型组VIP-R1 mRNA的表达(1.522±0.278)明显上调(P＜0.05)，其变化趋势与VIP含量改变一致。经过眼针刺激，眼针组VIP-R1 mRNA的表达量(0.440±0.201)与模型组比较则明显下调(P＜0.05)。提示眼针对D-IBS模型大鼠结肠中VIP-R1 mRNA高表达具有抑制作用。

图3 眼针对D-IBS模型大鼠结肠组织中VIP-R1蛋白表达影响(DAB，×400)

图4 眼针对D-IBS模型大鼠结肠组织中VIP-R1 mRNA表达结果影响

3 讨论

IBS是以腹痛或腹部不适，伴有大便形状和排便习惯改变为特征的功能紊乱性肠道疾病，临床检查多无明显器质性和异常的生化指标变化。目前临床多倾向于以罗马Ⅲ标准进行分型，该分型主要以粪便中含水量为重要依据，其中尤以腹泻型占据比例最大〔5，6〕。关于D-IBS发病机制仍不十分清楚。研究发现D-IBS患者结肠黏膜上皮细胞水通道蛋白(AQPs)表达发生明显改变〔7～9〕，提示与结肠组织水分子的转运功能异常而导致了内脏高敏感性有关。本实验结果显示，模型组大鼠除了一般状态出现各种类似人类的焦躁、抑郁等精神神经性改变外，其腹泻、大便中含水量均多于正常组，同时伴有AWR分值升高，支持了D-IBS状态下结肠水分子转运功能异常与内脏高敏感性存在的观点。

AQPs是近年来发现的细胞膜内外转运水分子的关键性蛋白，已经发现分布在消化道，特别是结肠组织的AQPs类型与数量多而广泛，其中以AQP3和AQP8与结肠水分子转运功能关系最为密切。实验证实D-IBS患者大便含水量增多，排便频率增加，是由于结肠黏膜上皮细胞AQPs的表达下调所致〔7，8〕。对于AQPs表达的调控研究表明，VIP是调控人结肠上皮细胞AQP8表达的主要脑-肠肽物质之一〔10〕，并发现D-IBS患者以及脾虚腹泻动物等血和结肠组织中VIP水平均升高〔11～13〕，从而支持了D-IBS状态下的腹泻发生机制可能与VIP分泌增加影响了AQPs表达的推测。

VIP受体是介导VIP信息传递的靶标蛋白分子，VIP信息传递所引起的生物效应不但取决于血清及组织中含量，而且与VIP受体在靶细胞表达量有着直接关系。VIP受体(VIP-R)已经被克隆出3个亚型，属于G蛋白耦联型受体〔14〕，分布在消化道的VIP受体分为VIP-R1和VIP-R2两种亚型，其中VIP-R1表达部位主要在结肠黏膜上皮细胞上，VIP-R1与VIP具有高亲和力。VIP与VIP-R1结合后激活G蛋白耦联受体，可能通过cAMP-PKA跨膜信号转导途径影响了AQPs的表达〔15〕。

本实验结果发现，模型组大鼠血清、结肠组织中不但VIP含量显著增加，而且结肠组织细胞上VIP-R1表达也明显上调。由此认为，D-IBS状态下由于体内VIP过量分泌与释放的同时，结肠组织细胞上的VIP-R1高表达是加剧了VIP的病理生理效应又一重要原因。由于VIP含量增高及VIP-R1的高表达则影响了AQPs表达，进而降低了结肠内水液的转运能力，导致了内脏敏感性增加。

眼针疗法是彭静山教授依据中医学经典脏腑、经络等理论，运用五轮、八廓以及八卦学说，并结合多年的临床经验所创立的一种微针疗法〔16〕。是将眼睛周围按照八卦分为八区十三穴，而对应人体相应的五脏六腑、器官组织等。通过辨证选取相应的穴位进行针刺而达到治疗全身不同部位疾病的目的。本实验运用眼针方法选取相应穴位进行刺激后，在D-IBS大鼠一般状态得到恢复，以及腹泻症状得到控制的同时，其血清和结肠组织VIP水平出现明显下降，结肠组织细胞上VIP-R1的蛋白与基因表达也出现明显的下调。提示了眼针治疗D-IBS腹泻和内脏高敏感性的机制之一，可能与抑制血中、结肠组织中VIP过量分泌与释放，同时下调结肠相关细胞上VIP-R1的表达有关。由于VIP含量下降和受体表达下调则减轻或解除了对AQPS影响，使结肠内水液转运功能得以恢复，并降低内脏敏感性的异常，而达到了治疗D-IBS的效果。

在本实验中，眼针对于血清，特别是对结肠组织中VIP含量、VIP-R1受体表达的影响途径，VIP对结肠组织细胞上何种类型AQPS表达进行影响，以及是否还通过其他信号转导途径对AQPS进行影响等，均有待于进一步研究证实。无疑，阐明这些问题将对眼针治疗D-IBS的机制将会提供更多依据。

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