格尔德霉素对肝细胞生长因子诱导的胶质瘤细胞侵袭能力的影响

王春辉 刘松岩 韩雪梅 (吉林省人民医院神经外科，吉林 长春 30000)

胶质瘤是中枢神经系统最常见的肿瘤，侵袭性生长是其重要的生物学特性，是外科手术难以彻底切除和术后复发的主要原因。多年来，胶质瘤侵袭性生长的发生机制一直是研究的热点。已经证实，肝细胞生长因子(HGF)能够诱导肿瘤细胞侵袭性生长〔1〕，格尔德霉素(GDM)作为一种抗肿瘤抗生素，对HGF具有明显的抑制作用。本研究探讨GDM对HGF诱导的胶质瘤细胞侵袭能力的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与细胞株 HGF购自美国Calbiochem公司，GDM购自美国Sigma公司，Matrigel胶购自美国BD公司，Transwell小室购自美国Pierce公司。人胶质瘤细胞株U251-MG和U87-MG由吉林省肿瘤研究所提供，NIH3T3细胞为吉林大学基础医学院免疫教研室提供。

1.2 细胞培养及实验分组 37℃，5%CO2条件下，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养U87和U251细胞。用终浓度为 30 μg/L的 HGF作用 24 h后，再加入浓度为500 nmol/L的GDM处理48 h，进行Transwell实验。实验分为正常对照(NC)组、HGF组、GDM组和HGF+GDM组。

1.3 条件培养液的制备 运用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养NIH3T3细胞至细胞汇合，用无血清的培养基洗3次。然后加入新鲜无血清培养基，37℃，5%CO2培养箱培养48 h。收集培养上清液过滤，即为含趋化因子的条件培养基，－70℃存储备用。

1.4 Transwell实验 取Matrigel胶，用无血清培养基按1∶3稀释混匀，以80 μl/孔加至Transwell小室的上室聚碳酸酯膜上(整个操作在冰上及无菌条件下进行，所有器皿及试管均事先预冷)。37℃下聚合30 min。将经过HGF和GDM预先处理的细胞在无菌超净台内用0.25%胰酶消化，PBS洗1次，台盼兰计数活细胞数，无血清的培养基调细胞浓度为1.0×106个/ml，24孔板内加入NIH3T3条件培养液，200 μl/孔，将制备好的Transwell小室置于其内，上室加入100 μl细胞悬液，使每孔含有细胞数为1.0 ×105个，于37℃，5%CO2条件下培养18 h。弃去上室中的培养液，并用生理盐水棉签轻轻檫去Matrigel胶，采用0.1%结晶紫染色，倒置显微镜观察，10×40倍视野下任取5个不重复视野照相，并记录侵袭细胞数量。

1.5 统计学方法 采用SPSS12.0软件进行方差分析及q检验。

2 结果

与NC组相比，HGF显著提高了两种胶质瘤细胞的侵袭能力(P＜0.05);GDM作用48 h后，U87及U251细胞穿膜细胞数显著低于NC组及HGF组(P＜0.05);GDM+HGF组两种胶质瘤细胞穿膜细胞数量明显低于NC组及HGF组(P＜0.05)，接近于GDM组，即GDM抑制了HGF诱导的促进胶质瘤细胞侵袭能力。NC组有较多细胞穿过Matrigel胶进入下室中。HGF组侵入下室细胞数量明显多于NC组。GDM组侵入下室细胞数量明显少于NC组和HGF组。HGF+GDM组侵入下室细胞数量明显少于 NC组及 HGF组，接近于 GDM组。见表1和图1。

图1 各组胶质瘤细胞侵袭能力比较(×400)

与NC组比较:1)P＜0.05;与HGF组比较:2)P＜0.05

3 讨论

胶质瘤侵袭性生长表现为广泛的局部侵袭而罕见的远处转移，其侵袭方式主要有三种:沿神经细胞、沿血管组织和沿白质髓鞘纤维。其侵袭过程涉及多个步骤:肿瘤细胞通过细胞膜表面受体黏附到细胞外基质(ECM)层黏蛋白上;蛋白水解酶前体的释放和活化;蛋白水解酶对ECM，主要是Ⅳ型胶原的水解;瘤细胞伸出伪足向被降解的基质区域运动，形成局部侵袭生长〔2〕。此过程至少两次与ECM接触，如缺乏能够有效降解IV型胶原的酶，则肿瘤的侵袭转移过程难以实现。因ECM主要是Ⅳ型胶原构成，包括基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9与肿瘤侵袭转移关系最密切〔3～5〕。Sun等〔3〕构建了 MMP-9 反义RNA载体，降低了MMP-9的表达，体外实验显示细胞增殖明显受到抑制，体内实验显示，肿瘤体积、重量、微血管密度和增殖活性均明显下降。此外，有学者使用RNA干扰技术同时沉默了喉癌HEP-2细胞株中MMP-2和MMP-9的表达，发现HEP-2细胞分泌MMP-2和MMP-9能力下降的同时，出现细胞生长受到抑制，侵袭实验表明其侵袭能力明显下降〔6〕。关于HGF与MMP-2关系，Tsou等〔1〕报道HGF能够增加软骨肉瘤细胞MMP-2的表达，并促进细胞转移。选择性抑制MMP-9的表达能降低胶质瘤细胞的侵袭能力〔7〕。此外，因肿瘤的生长离不开大量的新生血管，而MMP-2和MMP-9能够通过降解基底膜来促进血管内皮细胞的迁移，促进新生血管的形成〔2〕，为肿瘤增殖提供条件，提高肿瘤的恶性程度。

已经证实，格尔德霉素或其衍生物17-AAG能抑制MMP-2及MMP-9的分泌和活性〔8〕。课题组前期使用明胶酶谱法测定U87和U251胶质瘤细胞MMP-2及MMP-9活性。结果表明:肝细胞生长因子可显著增强MMP-2和MMP-9活性;格尔德霉素能够显著抑制胶质瘤细胞 MMP-2、MMP-9的活性，并能抑制HGF引起的MMP-2和MMP-9活性增强〔9〕。

本研究表明:HGF可明显增强胶质瘤细胞侵袭能力，而GDM对胶质瘤细胞的侵袭能力有显著的抑制作用，并抑制了HGF增强胶质瘤细胞侵袭的能力，可能是通过抑制胶质瘤细胞MMP-2、MMP-9的活性，进而抑制了其侵袭。

1 Tsou HK，Chen HT，Hung YH，et al.HGF and c-Met interaction promotes migration in human chondrosarcoma cells〔J〕.PLoS One，2013;8(1):e53974.

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4 Mou L，Kang Y，Zhou Y，et al.Neurokinin-1 receptor directly mediates glioma cell migration by up-regulation of matrix metalloproteinase-2(MMP-2)and membrane type 1-matrix metalloproteinase(MT1-MMP)〔J〕.J Biol Chem，2013;288(1):306-18.

5 Kesanakurti D，Chetty C，Rajasekhar Maddirela D，et al.Functional cooperativity by direct interaction between PAK4 and MMP-2 in the regulation of anoikis resistance，migration and invasion in glioma〔J〕.Cell Death Dis，2012;3:e445.

6 孙亚男，杨宝峰，刘 鸣，等.基质金属蛋白酶-2和-9基因同时沉默抑制喉癌侵袭生长的实验研究〔J〕.中华医学杂志，2008;88(1):36-9.

7 Jung JS，Jung K，Kim DH，et al.Selective inhibition of MMP-9 gene expression by mangiferin in PMA-stimulated human astroglioma cells:involvement of PI3K/Akt and MAPK signaling pathways〔J〕.Pharmacol Res，2012;66(1):95-103.

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9 王春辉，罗毅男，李蕴潜，等.格尔德霉素对HGF诱导的人胶质瘤细胞MMP-2及MMP-9活性的影响〔J〕.中国老年性杂志，2008;28(1):11-3.