民族药光石韦中总黄酮的提取工艺及含量测定研究Δ

张奇龙 徐 红 王 丽 肖 竦

（贵阳医学院化学教研室,贵州贵阳550004）

光石韦为水龙骨科蕨类植物光石韦Pyrrosia calvata(Bak.)Ching的全草，别名大肺痨草。具有清热、利尿、止咳、止血的功效，主治：肺热咳嗽、痰中带血、小便不利、热淋、沙淋、颈淋巴结核、烧烫伤、外伤出血[1,2]。石韦属植物含有黄酮类化合物[3]。研究表明，黄酮类化合物具有抗过敏、降血压、抗炎、抗菌、抗突变、抗溃疡、抗病毒、保肝和降血脂等活性[4]。鉴于黄酮类化合物具有多种生理活性，对黄酮的研究具有重要的意义。不同种的石韦中总黄酮及其它有效成份的含量可能存在差异，这会导致不同种石韦在药用功效上的不同，通过对这些物质的测定，可对药材的品质进行评价[5]。已有文献报道对石韦、毡毛石韦、华北石韦、有柄石韦、庐山石韦中的总黄酮进行提取和含量测定[6,7]。但是，对光石韦中总黄酮含量的提取和测定未见文献报道。我们对光石韦中总黄酮的提取工艺及含量测定进行研究，为光石韦的有效利用提供参考。本实验采用正交实验设计探究光石韦总黄酮的提取工艺，以芦丁为对照品，用紫外分光光度法测定总黄酮含量。

1 仪器与材料

1.1 仪器:UV-2401型分光光度计 (日本岛津)，BS210S型万分之一电子天平 (北京赛多利斯仪器系统有限公司)；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)，RE-52AA旋转蒸发仪 (上海亚荣生化仪器厂)，DF-101S数控集热式磁力搅拌器 (杰瑞尔电器有限公司)，HH-S数显恒温水浴锅(江苏省金坛市医疗仪器厂)。

1.2 材料:光石韦 (Pyrrosia calvata(Bak.)Ching)药材采自贵州省安顺市紫云县候场镇，经贵阳中医学院赵俊华教授鉴定为光石韦。无水乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、石油醚(试剂为分析纯)。

2 实验方法

2.1 总黄酮的测定方法

2.1.1 对照品溶液的制备：精密称取芦丁标品 (干燥)20 mg，置于70%微热乙醇中超声溶解，定容至 200 mL，摇匀，得浓度为0.1 mg·mL-1的芦丁标准溶液。

2.1.2 吸收波长的选择：根据文献方法[8]精密量取芦丁对照品液5.0 ml至25 ml容量瓶中，加5%NaNO2溶液0.3 mL，摇匀，放置 6 min，加 10%Al(NO3)3溶液 0.3 mL，摇匀，放置 6 min，加 1 mol/L NaOH溶液 4 mL，加70%乙醇 0.4 mL，摇匀，放置 15 min，置于比色皿中，在波长400～600 nm之间测定吸光度，结果最大吸收波长在510 nm。

2.1.3 标准曲线的制备：分别精密吸取上述芦丁标准0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于 6只 15 mL具 塞 试 管中，分别加 70%乙醇至 5 ml，加 5%NaNO2溶液 0.3 mL，摇匀，放置 6 min，加 10%Al(NO3)3溶液 0.3 mL，摇匀，放置 6 min，加 1 mol/L NaOH溶液 4 mL，加 70%乙醇0.4 mL，摇匀，放置 15 min，于 510 nm波长处以第一支试管溶液为空白对照，测定吸光度，结果见表1。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，建立回归方程 A=11.238C-0.0022，r=0.99928。

表1 浓度与吸光度

2.1.4 光石韦中总黄酮的提取和含量测定：将光石韦洗净，低温烘干，用电动植物粉碎机粉碎。称取100 g于烧杯中,加入石油醚浸泡过夜脱脂去色，然后经布氏漏斗抽滤，滤渣风干，得脱脂去色的光石韦样品，精确称取脱脂去色的光石韦样品9份，每份 5.0 g，按照三因素三水平实验设计(见表2)的 9种提取方案，分别回流提取材料中的总黄酮，过滤收集滤液，将滤液减压浓缩并回收乙醇，得浸膏。将浸膏在60℃下真空干燥，研碎后得光石韦总黄酮粗提物。精密称取浸膏 10 mg，溶解，定容至 25 mL，精密量取 4 mL的供试品溶液，自“加 70%乙醇溶液至 5 mL……”同上，以 70%乙醇为空白试剂，在最大吸收波长处测定各供试液的吸光度，并计算总黄酮含量。

2.1.5 精密度实验：称取脱脂去色的光石韦样品5.0 g，利用正交实验选取的最佳方案制备供试品溶液。测定方法同上，连续测定5次。计算相对标准偏差RSD值为0.28%，表明该方法精密度良好 。

2.1.6 稳定性试验:取供试品溶液，于 10、20、30、40、50、60 min时测定吸收值。计算 60 min内吸光度的RSD值为 0.30%，表明吸光度在60 min中内稳定。

2.1.7 重复性试验:称取脱脂去色的光石韦样品 6份，每份5.0 g，按正交试验优选的提取工艺进行提取，再按“2.1.4样品含量测定”项进行分析，计算样品中总黄酮含量的 RSD值为 2.10%(n=6)，表明重复性良好。

2.1.8 回收率实验:精密称取已知总黄酮含量的光石韦样品 6份，每份5.0 g，加入适量标准品，按正交试验优选的提取工艺进行提取，再按“2.1.4样品含量测定”项进行测定，经计算得平均回收率为 99.00%，RSD值为2.20%，表明回收率良好。

2.2 提取工艺的优选

2.2.1 正交试验设计：为了系统考察乙醇提取法的条件参数，确定乙醇提取光石韦中黄酮的最佳工艺条件，我们选择以总黄酮得率为考察指标，将各考察因素取3个水平进行了L9(34)正交试验，以考察乙醇浓度、料液比、提取次数、提取时间对总黄酮得率的影响。因素水平表见表2。

表2 因素水平表

总黄酮提取正交实验的结果与分析见表3。由表3中极差分析可知，各因素依次为A>B>C>D，以A2B2C2D1最佳。

2.2.2 工艺的验证试验:精密称取脱脂去色的光石韦样品 3份，每份5.0 g。按上述正交试验优选的提取工艺进行提取，再按“2.1.4样品含量测定”项下进行分析，计算总黄酮含量得光石韦中总黄酮的平均含量为6.803%，RSD值为 1.72%(见表4)。

表3 正交实验结果分析

表4 工艺验证试验结果

3 讨 论

黄酮类化合物是一大类天然产物，是石韦等许多中草药的有效成分，具有抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抑菌抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗辐射等功效[9]。如何利用有限的光石韦资源，得到最高的黄酮产量是很有意义的。本文根据正交设计实验从光石韦中提取总黄酮，其优选的最佳工艺条件为：料液比为1:20的55%乙醇，回流提取2次，每次2 h。测得光石韦中总黄酮的平均含量为6.803%。比文献报道的庐山石韦[7]，石韦[6]中的总黄酮含量高。不同种石韦总黄酮含量存在显著差别，而总黄酮含量的巨大差别启示不同种石韦可能具有不同的药用功效，相关的工作值得进一步研究。

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[2]潘炉台,赵俊华,孙庆文.贵州药用蕨类植物[M].贵州:贵州科学出版社,2012:312.

[3]谢来成.武当山药用植物第一卷[M].北京:中国医药科技出版社,2006:98-99.

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[6]王自军,杨红兵,齐誉,等.正交设计研究石韦总黄酮和鞣质提取工艺[J].时珍国医国药,2007,18(2):463.

[7]王瑞兰,易俗,陈康贵,等.庐山石韦中黄酮的提取工艺研究[J].长沙电力学院学报,2003,18(4):84-86.

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