SPE－UPLC－MS／MS快速测定豆制品中的乌洛托品

周秀云，赵 勇，俞 婧

（1.鹿泉市食品质量安全监督检验中心，河北 鹿泉 050200；2.河北省食品质量监督检验研究院，河北 石家庄 050091）

乌洛托品，学名六亚甲基四胺（hexamethylenetetramine，C6H12N4），是甲醛和氨的缩合物，为白色具有光泽的结晶或结晶性粉末，能发生众多化学反应，在酸性溶液中能分解放出甲醛和氨，易与体内多种化学结构的受体发生反应，使蛋白质变性。甲醛在体内还可还原为甲醇，对人体的肾、肝、中枢神经、免疫功能、消化系统等均有损害。因此，我国明令禁止将乌洛托品添加到食品当中。近年来，一些不法厂家在豆制品中添加乌洛托品来改善豆制品的颜色，增加口感，防治腐败变质等。随着人们对食品安全的关注，豆制品的安全性已成为关注的焦点之一。为此，笔者对豆制品中乌洛托品的检测进行了研究。

目前，关于乌洛托品的检测，国标法只发布了动物源食品的检测方法［8］，对于豆制品的检测目前尚未有标准建立。乌洛托品的检测方法，目前主要有分光光度法［1］，高效液相色谱法［2］，高效气相色谱法［3，4］，激光拉曼光谱等［5］。其中分光光度法具有仪器设备简单，易于进行的特点，但检测的干扰较大，灵敏度较低；高效气相色谱法和高效液相色谱法具有准确，线性好，回收率高的特点，研究报道较多，但检测的灵敏度不高。高效液相色谱质谱联用法［6，7］除了具备高效液相色谱所具有的准确度高，线性好等特点外，还具有更低的检测限，更高的检测灵敏度，可以为豆制品中乌洛托品的检测提供高灵敏度的分析方法。本研究拟采用超高相液相色谱质谱联用技术测定豆制品中的乌洛托品，以期为豆制品中乌洛托品的检测提供技术支持，同时加速豆制品中乌洛托品检测标准的建立进程。

1 实验与方法

1.1 仪器与材料

UPLC－MS／MS8030超高效液相色谱－串联质谱仪；固相萃取装置（美国Agilent公司），ProElut PXA 固相萃取柱（150mg／6ml，迪马科技）。

1.2 试剂

乌洛托品标准品（购于Sigma，纯度＞99.0%），乙酸、乙腈为色谱纯；实验用水均为超纯水。

1.3 分析步骤

1.3.1 标准溶液的配置

准确称取乌洛托品标准品0.1g，用乙腈溶解并定容至100mL，摇匀备用，配制成浓度为1.00mg／mL的标准储备液。再从上述标准储备液中分别吸取1.00mL、2.00mL、4.00mL、8.00mL、16.00mL 于5 个100mL 容量瓶中，并用乙腈定容至刻度，配制浓度分别为10ug／mL、20ug／mL、40ug／mL、80ug／mL、160ug／mL系列标准使用液，混匀后即可进样。以标样峰面积的比值对应乌洛托品浓度绘制标准曲线，建立相应的回归方程。

1.3.2 样品处理

提取：将1.0g（已粉碎均匀）样品和1.0g无水硫酸钠置于20mL 塑料离心管中，加入5mL乙腈，涡旋混合2min，超声20min，6000rpm 下离心5min。取上清液，待净化。

净化：将提取液上样于已与5mL乙腈活化的ProElut PXA 固相萃取小柱，收集流出液后采用1mL乙腈洗脱，流出液合并洗脱液在45℃下氮吹近干，最后用1mL 0.1%乙酸－乙腈溶解，过0.22μm 滤膜，待测。

1.4 检测条件

色谱柱：shim－pack XR－ODSⅢ（2.0mm＊75mm，1.6μm）；流速：0.3mL／min；流动相A：0.1%乙酸水，60%；流动相B：乙腈，40%；柱温：30℃；进样量：10μL。

质谱方式：电离方式：ESI＋；反应监控扫描（MRM）模式；毛细管电压：3.5kV；源温度：110℃；脱溶剂温度：350℃；脱溶剂气流量：600L／h。

2 结果与讨论

2.1 SPE柱的选择

利用固相萃取小柱（SPE）中的固体吸附剂吸附样品中的杂质，使被测物质被洗脱并杂质分离，达到进一步分离目标化合物的目的。比较了C18、ProElut PXA 和OasisMCX3种不同类型的固相萃取柱的净化效果。其中ProElut PXA 和OasisMCX 的净化效果接近，优于C18，但ProElut PXA 价格略低于OasisMCX，故采用ProElut PXA 作为本实验净化用SPE柱。试验在空白试样中添加浓度均为10.0μg／kg的标准物质，平行3次使用试验ProElut PXA 固相萃取，各物质回收率在82.9%～100.8%之间，满足检测要求。

2.2 质谱条件的选择

由于乌洛托品负电子结构本，故实验采用正离子电离模式，多反应监测MRM，测定，由于采用超高效液相色谱分离技术，使得样品测定可在1min内完成，流速设定为2.0mL／min，峰与杂质实现了基线分离，最佳质谱条件如表1，各组分具有良好的分离度、响应值及离子碎片，见图1、图2。

表1 乌洛托品的质谱分析优化参数

图1 乌洛托品的标准MRM 色谱图

图2 乌洛托品的标准子离子碎片色谱图

2.3 灵敏度

以标准溶液浓度为横坐标（x），定量离子对色谱峰面积为纵坐标（y），求得回归方程y＝35.1600x－0.648027。乌洛托品在10.0～160μg／kg范围内其线性关系良好，相关系数均大于0.999。

以3倍信噪比（S／N＝3）对应的目标物浓度作为检出限，以10倍性噪比（S／N＝10）对应的目标物浓度作为定量限，得到乌洛托品的方法检出限和定量限分别为3μg／kg和1μg／kg，见图3。

图3 乌洛托品检出限的标准MRM 色谱图

2.4 回收率及精密度

本方法用于市场销售的实际样品测定，未发现阳性样品。采用标准添加法，空白样品中分别添加5，20，100μg／kg标准品，进行回收率试验。表2是添加3个水平的回收率及精密度。由数据可以看出，乌洛托品在三种添加水平下平均回收率为88.4%～97.1%，相对标准偏差为5.39%～8.74%，能够满足豆制品中痕量乌洛托品检测的需要。

表2 不同添加水平下乌洛托品的加标回收率、相对标准偏差（n＝6）

3 结论

本研究工作中所建立的SPE－UPLC－MS／MS法测定豆制品中乌洛托品的检测方法，样品前处理提取率高、有机溶剂使用量少，方法灵敏度高，选择性和特异性好，采用超高效液相色谱技术有效缩短了检测时间，结果准确。本方法的回收率、精密度和检出限优于文献报道值。本方法的定量限可保证豆制品中乌洛托品的定性与定量检测，是测定豆制品中非食用物质乌洛托品的一种可供选择的方法。

［1］辛志伟，臧志和，赵小玉，等.分光光度法测定乌洛托品含量的研究［J］.数理医药学杂志，2001，14（5）：569－570.

［2］李莉，张钢平.高效液相色谱法测定乌洛托品片的含量［J］.中国医院药学杂志，2009，（4）：335－336.

［3］李薇，陈天科，徐绘，等.乌洛托品的气相分析［J］.仪器分析，2007（3）：29－31.

［4］黄国春.气相色谱法测定腐竹中乌洛托品含量的研究［J］.广西轻工业，2008，（6）：26－27.

［5］刘春伟，仲雪，马宁.激光拉曼光谱法快速测定腐竹中的微量乌洛托品［J］.食品安全质量检测学报，2012，3（4）：306－308.

［6］冼燕萍，陈立伟，罗东辉，等.UPLC－MS／MS 测定腐竹和米粉中的乌洛托品［J］.江南大学学报（自然科学版），2012，（11）：78－82.

［7］张爱芝，张书芬，王全林，等.超高压液相色谱－串联质谱法测定腐竹、米线、年糕中的乌洛托品［J］.食品安全质量检测学报2013，（4）：472－478.

［8］SN／T 2226－2008进出口动物源性食品中乌洛托品残留量的检测方法液相色谱－质谱／质谱法.