应用SELDI-TOF-MS技术筛选结肠癌术后原位复发患者的血清诊断标志物

王志红，漆永平，谢小平，华为民

湖北省黄冈市黄州区人民医院消化内科，湖北 黄冈 438000

结肠癌是发生于结肠部位的常见消化道恶性肿瘤，占胃肠道肿瘤的第3位［1］。结肠癌患者在发病早期多采用手术治疗的方法，但是手术治疗之后往往会伴随结肠癌的复发及转移。因此寻找预测结肠癌早期复发和转移的指标十分重要［2］。蛋白质组学处于当今生命科学研究领域的前沿，蛋白指纹图谱技术是研究蛋白质组的技术手段之一，由表面增强激光解析电离飞行时间质谱(surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS)和蛋白芯片两部分组成，SELDI-TOF-MS技术是一种新兴的比较蛋白质组学技术。应用其比较蛋白质组学技术来筛选肿瘤发生、发展和转移的标志物是非常有前景的一项研究［3］。

本研究应用SELDI-TOF-MS技术分析结肠癌术后原位复发患者和结肠癌术后无复发患者的血清蛋白指纹图谱的差异，筛选出预示结肠癌术后原位复发的特异性蛋白，从而寻找提示结肠癌术后原位复发的特异性生物标志物。

1 资料与方法

1.1 临床资料 结肠癌术后原位复发组和结肠癌术后无复发组患者各选取30例，来自2010年6月－2012年6月湖北省黄冈市黄州区人民医院住院的患者，经临床检查、影像学资料和病理学确诊为结肠癌的患者60例，结肠癌术后原位复发组，男18例，女12例，平均年龄(67.3±4.5)岁;结肠癌术后无复发组，男14 例，女16 例，平均年龄(65.9 ±5.7)岁;两组患者平均年龄和性别的差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性;所有入选患者均无影响血清中蛋白质含量的其他疾病(如肝脏疾病、肾脏疾病和内分泌疾病等)。所有研究对象均同意并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 主要仪器:SELDI-TOF-MS购自美国 Ciphergen公司。

1.2.2 采集血清标本:结肠癌术后原位复发组和结肠癌术后无复发组共60例，取5 ml清晨空腹时静脉血，置干燥管内，4℃下3500 r/min离心15 min，取上层血清，装入EP管中，放入－80℃冰箱中保存。

1.2.3 处理血清样品:－80℃冰箱中取出血清样品，解冻后4℃下2000 r/min离心10 min，每个样品取10 μl，置于 1.5 ml的离心管中，加入 20 μl U9 缓冲液，4℃下200 r/min离心30 min，使蛋白变性。

1.2.4 样品中蛋白质与芯片(磁珠)的结合:取100 μl WCX2磁珠，加入200 μl PCR管中，置磁力架上，1.5 min后弃上清，加100 μl WCX缓冲液进行磁珠预活化5 min，重复上述步骤1次。向活化的磁珠中加入10 μl处理好的血清样品，充分混合，室温孵育30 min，置磁力架上，1.5 min后弃上清，加100 μl WCX缓冲液进行WCX2磁珠的洗脱，重复上述步骤1次。后加入 10 μl洗脱液(1%TFA)，取 1 μl富含蛋白的洗脱液上样到Au/Steel芯片上，1 μl SPA饱和溶液上样到Au/Steel芯片上，风干后放入芯片阅读仪中检测。

1.2.5 检测芯片和采集数据:采用PBSⅡ型蛋白质芯片阅读仪对芯片进行检测，计算机以1×109/s的速度将获取的原始数据转换为蛋白质指纹图谱。使用Ciphergen proteinchip 3.0软件校正数据。质谱图的横坐标表示蛋白质的质荷比(M/Z)，纵坐标表示蛋白质的相对含量。

1.3 统计学分析 应用Biomarker Wizard软件对数据进行统计学分析，同时应用SPSS 16.0软件对数据进行处理，P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

结肠癌术后原位复发组和结肠癌术后无复发组血清中蛋白峰差异的筛选，设定蛋白质的分子质量位于2000～20000 D，低于2000 D的蛋白峰自动被清除，以排除一些化学成分对实验结果的影响。采用Biomarker Wizard软件对数据进行分析，发现结肠癌术后原位复发组与结肠癌术后无复发组有9个蛋白峰差异统有统计学意义(P ＜0.05)，分别是 2687.5 D、4506.1 D、5571.2 D、6879.3 D、7731.3 D、8266.5 D、8969.7 D、12408.1 D 和18257.6 D，其中有2 个蛋白峰7731.3 D和8266.5 D的差异有统计学意义(P＜0.01，见图1、图2)。这2个蛋白峰在结肠癌术后原位复发患者中高表达，在结肠癌术后无复发患者中低表达。

3 讨论

全球每年新发大肠癌患者高达93万，在我国每年新发病例高达13～16万人，在消化道肿瘤中大肠癌的发病率仅次于胃癌，大肠癌已经成为中国三大癌症之一，其发病率正以4.2%的速度螺旋式递增，远超国际水平［4］。结肠癌治疗原则是以手术切除为主的综合治疗，同时联合化疗、放疗等降低手术后复发率和转移率，提高生存率。但总有一部分结肠癌患者手术后在不同时期发生原位复发，从而导致结肠癌术后生存时间明显缩短［5］。寻找一种能早期发现其原位复发的指标有助于早期治疗，延长存活率，但目前还无一种简单、快捷、创伤小的检查手段能及时准确提示结肠癌术后发生了复发。

近几年，蛋白质组学技术迅速发展，其将会是阐明癌症发生的机制及提供有效防治措施最有力的手段［6］。自从2002年该技术发明之后，SELDI-TOF-MS技术广泛应用在肿瘤的早期诊断、冠心病的早期预测等方面。它可以检测到与肿瘤发生密切相关的小分子蛋白质。研究表明，SELDI-TOF-MS技术是当前最有希望的肿瘤早期检测方法［7］。

本研究应用SELDI-TOF-MS技术对比分析30例结肠癌术后原位复发患者和30例结肠癌术后无原位复发患者的血清蛋白指纹图谱，Biomarker Wizard软件对数据进行统计学分析后发现有9个的蛋白峰差异有统计学意义(P＜0.05)，在9个蛋白峰中，相对于结肠癌术后发生原位复发组的高蛋白峰有2个。2个蛋白峰7731.3 D和8266.5 D差异有统计学意义，表明这2个蛋白峰在结肠癌术后原位复发患者中表达明显增高，在结肠癌术后无复发患者中表达较低。这2个蛋白峰的发现在预测结肠癌术后原位复发中非常重要，为寻找早期预测结肠癌术后原位复发的标志物提供了资料。

SELDI-TOF-MS技术只需抽取血液，简单、方便［8］。SELDI-TOF-MS技术能够发现结肠癌术后原位复发患者血清中特异度高的蛋白峰，应用SELDI-TOFMS技术寻求疾病早期诊断的方法具有广阔的应用前景。SELDI-TOF-MS技术有望成为结肠癌术后原位复发人群的检测手段，从而达到早期发现结肠癌术后原位复发的患者。

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