猫锡兰钩虫rDNA ITS1的扩增及分子鉴定

刘远佳，郑国超，刘 田，任邵娜，李雅文，孟祥龙，Loutou H M，李国清

(华南农业大学兽医学院，广东广州510642)

锡兰钩虫(Ancylostoma ceylanicum)属于线虫纲、圆线目、钩口科、钩口属，成虫常寄生于犬、猫等多种哺乳动物消化道，通过吸食宿主血液而引起宿主贫血，严重的可以导致死亡[1]。Wijers等和Carroll等分别于1966年和1986年以实验感染的方式证明了人体能够感染锡兰钩虫[2-3]。而人体自然感染锡兰钩虫的病例在世界各地均有报道，如澳大利亚、荷兰、印度、菲律宾、老挝等[1,4-7]。这表明锡兰钩虫是一种重要的人畜共患寄生虫。研究显示，犬猫锡兰钩虫感染呈现地方性流行，主要分布在东南亚及澳洲一些国家，我国正位于犬猫锡兰钩虫的流行区，然而我国关于猫锡兰钩虫的报道却很少，自金大雄1965年首次在贵州家猫体内发现锡兰钩虫，Yoshida等1968年首次报道了我国台湾省猫锡兰钩虫感染至今，已有近半个世纪未见猫锡兰钩虫感染的报道[8-9]。本研究从广州市流浪猫粪便样品中分离到钩虫虫卵，通过直接提取虫卵基因组DNA，并以钩虫ITS1rDNA作为分子标记，采用PCR方法快速准确地将其鉴定为锡兰钩虫，为锡兰钩虫的分子生物学和分子流行病学研究奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 样 品 猫新鲜血便样品来源于一只10月龄雌性波斯猫，经60目过滤筛过滤两次，4500r/m in离心10min，弃上清液，沉淀中加入2倍体积2.5%重铬酸钾溶液，4℃保存待检；对照样品为华南农业大学寄生虫教研室保存的犬钩虫虫卵。

1.2 主要试剂 Ex Taq DNA聚合酶、DL2000DNA Marker、pMD18-T载体、JM 109感受态细胞购自TaKaRa公司；蛋白酶K、DNA提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自OMEGA公司。

1.3 显微镜检测 取血便样品的重铬酸钾混合液1m L～2m L，加入2倍体积蒸馏水，4000r/min离心5min，弃上层液，加入适量饱和氯化钠溶液混匀，1500r/m in离心3m in，加入饱和氯化钠溶液至满管，在其上放置一盖玻片，静置5m in，将盖玻片置于载玻片上，卢戈氏碘液染色，在400×显微镜下观察。

1.4 虫卵的纯化 将粪样重铬酸钾混合液加入2倍体积蒸馏水，4000r/m in离心10m in，沉淀中加入4倍体积饱和蔗糖溶液悬浮，1500r/m in离心5min，取上清液，加入5倍体积蒸馏水，6000r/min离心10m in，洗涤直至沉淀纯净。

1.5 基因组DNA的提取 将纯化虫卵4000r/m in离心5m in，弃大部分上清液，加入适量玻璃珠，100℃水浴加热5min，立即置于-80℃冷凝5min，反复5次，4000r/min离心5m in，弃上清液，加入适量缓冲液和蛋白酶K，漩涡振荡30m in，55℃水浴消化16h。按粪便DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA。

1.6 ITS1-5.8SrDNA部分序列的扩增、克隆和测序 以锡兰钩虫(DQ381541、DQ780009)、管型钩虫(JQ812691)、 犬 钩 虫 (AM 85010、AM 850105)、 巴 西钩虫(DQ359149、DQ438056)、狭头钩虫(HQ262053、AF194145)ITS rDNA序列作为参考，设计钩口属保守引物AF：5'-CTTTGTCGGGAAGGTTGG-3'和AR：5'-TTCACCACTCTAAGCGTCT-3'，对猫源钩虫ITS1+rDNA片段进行PCR扩增，反应体系25μL：10×Buffer 2.5μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，上下游引物(50pmol/μL)各 0.5μL，ddH2O 17.3μL，模板DNA 2μL，Ex Taq DNA 聚合酶(1U/μL)0.2μL；反应条件为：94℃5min；94℃30s、60℃30s、72℃50s，35个循环；72℃7min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测。将PCR产物纯化回收，克隆至pMD18-T载体中，由北京华大生物技术有限公司进行测序。

1.7 序列分析及分子进化树绘制 将测序结果录入GenBank，采用Blast进行比对，初步鉴定其种类。参照GenBank中6种钩虫ITS1相关的基因序列(DQ381541、 DQ780009、 AM 85010、 AM 850105、DQ359149、 DQ438056、 HQ262053、 AF194145、EU344797、 GQ859497、 JQ812691、 JQ812692)， 采用Clustal X和MEGA5.1软件计算出各序列间的遗传距离并绘制系统发育进化树。

2 结 果

2.1 虫卵形态 猫粪便样品中检测到虫卵呈椭圆形，两端钝圆，大小约35μm×60μm，卵壳与卵细胞间隙明显，含有两个或4个卵细胞，久置后，可以观察到卵细胞呈桑葚状，未染色无色透明，卢戈氏碘液染色后呈棕黄色(图1)。

图1 锡兰钩虫虫卵(400×)Fig.1Eggs of A.ceylanicum(400×)

2.2 目的基因PCR扩增结果 采用钩虫属保守引物AF和AR对虫卵基因组DNA进行扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳，获得约400bp的特异性片段，与预期相符(404bp)(图2)。

图2 猫源钩虫ITS1+rDNA的PCR扩增Fig.2PCR amplification of ITS1and partial 5.8S rDNA from the cat-derived Ancylostoma sp.

2.3 PCR扩增产物测序结果 将PCR扩增产物克隆至pMD18-T中并进行测序，结果显示，该序列长度为404bp，包括309bp ITS1(1bp～309bp)和95bp 5.8S rDNA(310bp～404bp)，其核苷酸序列为：

2.4 测序分析 将测得的ITS1序列与GenBank中登录的序列进行Blast比对，结果显示该序列与DQ780009.1、DQ381541.2的同源性最高，为100%，初步确定该株钩虫为锡兰钩虫。而且采用DNAStar软件中SepEd、MegA lign程序将其与犬钩虫、锡兰钩虫、巴西钩虫、十二指肠钩虫、狭头钩虫、管型钩虫ITS1rDNA相关序列比对显示，该钩虫的ITS1序列与印度犬源锡兰钩虫的相似度为100%，与澳大利亚犬源锡兰钩虫的相似度为99.7%，而与其他钩虫相似度均不高于97.5%，进一步确定该钩虫为锡兰钩虫。

2.5 系统发育进化树 采用Clustal X和MEGA5.1软件，以ITS1序列作为分子标记建立系统发育进化树，从遗传进化的角度确定该株钩虫为锡兰钩虫(图3)。

3 讨 论

图3 猫源钩虫ITS1以邻接法建立的系统进化树Fig.3Phylogenetic relationships of cat-derived Ancylostoma at the ITS1locus assessed by a neighbor-joining analysis

锡兰钩虫主要流行于东南亚各国及澳洲地区，我国正位于该虫的流行区域，周边多国均曾报道过该虫[4-7]，自金大雄、Yoshida等分别在贵州省和台湾省首次报道猫锡兰钩虫[8-9]至今，已有近半个世纪未见该虫报道，最近台湾省一例人体感染锡兰钩虫的病例[10]再次提醒我们，我国并非已经消灭了该虫，而是一直未能发现。

管型钩虫、锡兰钩虫、巴西钩虫是感染猫科动物3种常见的钩虫。其虫卵形态相似，显微镜检测难以区分，因此钩虫种类鉴定的早期研究均是通过从动物粪便或体内获取成虫，依据成虫的形态差异加以区分，但该方法耗时、耗力，对镜检人员的专业素质要求较高，并可能造成混合感染的漏检[8-9,11]。所以建立一种更为简便、精确、快速的鉴别方法对于钩虫的分类、流行病学及地理分布研究具有重要意义。

随着分子生物学的发展，研究人员开始尝试应用分子技术从遗传的角度区分不同种类钩虫。Gasser发现ITS序列可以作为区分管型钩虫、锡兰钩虫、犬钩虫、狭头钩虫的分子标记[12]，Traub发现ITS序列可以区分犬钩虫、锡兰钩虫、巴西钩虫[11]，Leandra再次证明ITS序列种内差异小，种间差异较大，具有高度的保守性，可以作为鉴别不同种钩虫的分子标记[13]。所以本研究选择ITS1作为分子标记，在国内首次采用分子生物学方法鉴定猫源钩虫的种类，通过对该株钩虫ITS1的扩增与测序，鉴定其为锡兰钩虫，测序结果丰富了锡兰钩虫的遗传学信息，为锡兰钩虫的分子遗传学和分子流行病学研究奠定了基础。本研究在近半个世纪以后再次在我国大陆地区发现猫锡兰钩虫，证明锡兰钩虫东南亚流行区域已连成一片，对于其地理分布、种群进化关系、种系发育研究具有重要意义。

[1]Palmer C S,Traub R J,Robertson I D,et al.The veterinary and public health significance of hookworm in dogs and cats in Australia and the status of A.ceylanicum[J].Vet Parasitol,2007,145(3-4):304-313.

[2]W ijers D J,Smit A M.Early symptoms after experimental infection of man w ith Ancylostoma braziliense var.ceylanicum[J].Trop Geogr Med,1966,18(1):48-52.

[3]Carroll SM,Grove D I.Experimental infection of humans with Ancylostoma ceylanicum:clinical,parasitological,haematological and immunological findings[J].Trop Geogr Med,1986,38(1):38-45.

[4]Anten J F,Zuidema P J.Hookworm infection in Dutch servicemen returning from West New Guinea[J].Trop Geogr Med,1964,64(756):216-224.

[5]Chowdhury A B,Schad G A.Ancylostoma ceylanicum:a parasite of man in Calcutta and environs[J].Am J Trop Med Hyg,1972,21(3):300-301.

[6]Velasquez C C,Cabrera B C.Ancylostoma ceylanicum(Looss,1911)in a Filipino woman[J].J Parasitol,1968,54(3):430-431.

[7]Sato M,Sanguankiat S,Yoonuan T,et al.Copro-molecular identification of infections with hookworm eggs in rural Lao PDR[J].Trans R Soc Trop Med Hyg,2010,104(9):617-622.

[8]庄生一，金大雄.贵州省食肉动物的钩口线虫类和锡兰钩虫的生活史研究[J].贵阳医学院学报，1982，7(2)：54-69.

[9]Yoshida Y,Okamoto K,Chiu J K.Ancylostoma ceylanicum infection in dogs,Cats,and man in Taiwan[J].Am JTrop Med Hyg,1968,17(3):378-381.

[10]Hsu Y C,Jaw-Town L.Intestinal infestation with Ancylostoma ceylanicum[J].N Engl JMed,2012,366(13):1241.

[11]Traub R J,Robertson I D,Irwin P,et al.Application of a species-specific PCR-RFLP to identify Ancylostoma eggs directly from canine faeces[J].Vet Parasitol,2004,123(3-4):245-255.

[12]Gasser R B,Stewart L E,Speare R.Genetic markers in ribosomal DNA for hookworm identification[J].Acta Tropica,1996,62(1):15-21.

[13]Clara E M,M iranda R C,Santos H A,et al.Differential diagnosis of dog hookworms based on PCR-RFLP from the ITS region of their rDNA[J].Vet Parasitol,2006,140(3-4):373-377.