2011年中国北方H9N2亚型禽流感病毒分离株HA基因进化分析及受体结合性检测

屈亚锦，屈秋锦，李 超，刘月月，石 迎，刘立涛，任庆海，刘思当*

(1.山东农业大学动物科技学院，山东泰安271018；2.山东省医疗器械产品质量检验中心，山东济南250101；3.夏津县畜牧兽医局，山东夏津253200)

H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza viruses,AIV)在世界范围内多种禽类中流行[1]，引起鸡呼吸道症状及产蛋率下降[2]，当与其他病原共感染时常导致鸡群的高死亡率[3]，给养殖业造成了严重的经济损失。我国自1994年首次在广东省分离到H9N2亚型AIV以来，该病毒在我国鸡群中广为流行，严重制约了我国家禽业的健康发展。此外，国内外有多起人感染H9N2亚型AIV的病例报道，许多血清学调查显示我国有一定比例的人群已经感染过H9N2病毒，血清阳性率高达13.7%～37.2%[4]。因此，对H9N2亚型AIV的监测不仅能够指导养禽业的健康发展而且具有重要的公共卫生意义。

血凝素蛋白(Hemagglutinin，HA)构成流感病毒囊膜纤突，是流感病毒所有蛋白中最重要的一个。HA主要功能包括与宿主唾液酸细胞受体特异性结合[5]；在病毒吸附和穿膜过程中起关键作用；HA上裂解位点的序列直接影响AIV的致病性[6]。但HA基因变异频率很高，抗原位点或潜在糖基化位点氨基酸的突变即可影响到病毒抗原性和致病性，受体结合区域氨基酸的变异能够导致病毒受体结合性的改变，进而影响病毒感染的宿主范围。因此，及时、准确判断H9N2亚型AIV的变异趋势对于有效预防该病具有重要意义。

本研究对2011年在中国北方地区家禽中分离到的11株H9N2亚型AIV扩增其HA基因，对其受体结合位点、潜在糖基化位点以及裂解位点进行比较分析，并对病毒受体结合特性进行了检测，为我国禽流感的科学防控提供一定的参考依据。

1 材料和方法

1.1 病毒株 本实验中11株AIVA/chicken/Shandong/091/2011(CK/SD/091/11)、A/chicken/Shandong/022/2011(CK/SD/022/11)、A/chicken/Henan/053/2011(CK/HN/053/11)、A/chicken/Liaoning/084/2011(CK/LN/084/11)、A/chicken/Shandong/0175/2011(CK/SD/0175/11)、A/chicken/Shandong/037/2011(CK/SD/037/11)、 A/chicken/Shandong/017/2011(CK/SD/017/11)、 A/chicken/Shandong/048/2011(CK/SD/048/11)、A/chicken/Hebei/099/2011(CK/HB/099/11)、A/chicken/Beijing/0110/2011(CK/BJ/0110/11)、A/chicken/Tianjin/0211/2011(CK/TJ/0211/11)由本实验室自山东、河南、河北、北京等中国北方地区的发病鸡或死亡鸡中分离，并鉴定为H9N2亚型，病毒接种SPF鸡胚，48h后收取鸡胚尿囊液，测定血凝效价，经细菌检验无污染后作为种毒贮存于-80℃备用。

1.2 主要试剂 High Pure Viral RNA Kit、RT-PCR Kit购自 Invitrogen公司；PCR M IX、大肠杆菌DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；α-2,3唾液酸酶购自TaKaRa公司；1%鸡红细胞由本实验室自制。

1.3 HA基因测序及分析 依据GenBank登录的H9N2HA序列，用软件Oligo4设计PCR引物，设计引物序列如下：HA F：GGGGAGCAAAAGCAG GGGAATTTC：HA R：GGTTATTAGTAGAAACAA GGGTGTTTTTGCCAAT，扩增长度为1620bp。按RNA提取试剂盒操作说明书，自尿液中提取病毒基因组RNA，用Unit 12：AGCAAAAGCAGG引物进行反转录，按常规法进行PCR。PCR产物经纯化后送华大基因公司测序。

测序结果经DNAStar 5.0软件推导氨基酸序列，对裂解位点、受体结合位点及潜在糖基化位点分析，并与GenBank中登录的国内外H9N2AIV株的HA基因序列进行比较和分析，用MEGA4.1绘制遗传进化树，用Bootstrap对进化树的可靠性进行评价，重复1000次，分析遗传进化关系。

1.4 红细胞法测定AIV受体结合特性 分别用自制的1%鸡红细胞，1%绵羊红细胞和1%唾液酸酶处理过的鸡红细胞，对待测病毒进行HA试验。其中鸡红细胞具有α-2,3及α-2,6两种唾液酸受体；绵羊红细胞已被证实只具有α-2,3唾液酸受体[7]；α-2,3唾液酸酶处理过的鸡红细胞只具有α-2,6唾液酸受体，通过病毒与以上几种红细胞结合特性的差别来判断流感病毒的受体结合特性。

判断标准：若病毒结合鸡红细胞及绵羊红细胞，而不结合α-2,3唾液酸酶处理过的鸡红细胞，表明该病毒只具有α-2,3唾液酸受体结合特异性。

若病毒结合鸡红细胞(α-2,3唾液酸酶处理过的和未处理过的)，而不结合绵羊红细胞，表明该病毒只具有α-2,6唾液酸受体特异性。

若病毒既结合鸡红细胞(α-2,3唾液酸酶处理过的和未处理过的)，又结合绵羊红细胞，那么该病毒既具有α-2,3唾液酸受体结合特性，也具有α-2,6唾液酸受体结合特性。

2 结 果

2.1 HA基因RT-PCR扩增 11株H9N2AIV提取的RNA经Unit 12反转录获得cDNA，以其为模板，以HA特异性引物进行PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，均得到了大小约为1600bp的扩增片段(图1)，与预期结果相符。

M：DNA Marker 5000；1：空白对照；2～12：检测样本M:DL5000Marker;1:Negative control;2-12:RT-PCR products from AIV isolates

2.2 HA基因进化分析 从世界范围内分离的H9N2亚型AIV，其HA基因的系统进化树分析显示4个主要分支，分别为BJ/94-like、G1-like、Koreanlike以及Ty/66-like。我国流行的H9N2病毒主要分布在BJ/94like分支，偶尔在珍禽和人中分离到属于G1-like分支的病毒，此次在我国北方家禽中分离到的11株家禽源H9N2病毒均属于BJ/94-like分支，但其中一株病毒与其他10株病毒处于不同的进化分支(图 2)。

2.3 HA基因关键氨基酸位点分析 流感病毒的血凝素蛋白切割位点的氨基酸序列特征是鉴定流感病毒致病力的一个重要指标。1999年之前我国流行的H9N2亚型AIV裂解位点均为PSRSSR/GLF模式，分析显示11株H9N2病毒裂解位点的P5位均出现了A336S变异，变为P-S-R-S-S-R模式，但仍保持非连续碱性氨基酸，符合低致病力AIV的序列特征(表 1)。

11株病毒中，除了CK/TJ/0211/11、CK/HB/099/11，其余9株病毒均具有8个潜在糖基化位点，值得注意的是所有病毒HA均出现了P295S变异，导致新增加了一个新的潜在糖基化位点，并且该位点靠近裂解位点，该位点是否能够影响病毒的裂解活性或者改变病毒的抗原性尚值得深入研究(表1)。

对11株病毒的受体结合位点氨基酸分析表明，相比于我国早期的H9N2亚型AIV，近期的病毒均由Q226L变异，之前曾有研究报道Q226L变异能够改变病毒的受体结合性，本次分离的病毒是否也出现受体结合性的改变将在随后的受体结合性试验中加以验证。

图111 株H9N2流感病毒的HA基因进化树Fig.1Phylogenetic trees of the HA genes of eleven H9N2influenza viruses isolated from Northern China

2.4 红细胞法测定病毒受体结合特性 利用只含有α-2,3唾液酸和α-2,6唾液酸受体的红细胞分别与病毒结合，测定病毒的受体结合特性。如表2所示，所检测的11株H9N2病毒与含有α-2,3唾液酸和α-2,6唾液酸受体的红细胞均能结合，表明我国北方流行的家禽源H9N2病毒同时具备α-2,3唾液酸和α-2,6唾液酸受体结合特性。

3 讨 论

本实验分离的11株病毒中10株处于BJ/94-like分支，1株处于不同的进化分支，表明我国北方家禽源H9N2病毒进化方向呈多元化。本实验表明11株H9N2病毒裂解位点均变为P-S-R-S-S-R模式，仍符合低致病力AIV的特征，但这种裂解模式的改变是否能够影响病毒的毒力尚值得深入研究。HA基因的潜在糖基化位点也是影响毒力的重要因素之一[8]。糖基化位点的增加或减少对病毒的抗原性以及其他生物学活性均具有一定的影响。潜在的糖基化位点可以通过两种方式影响AIV的毒力：一是受体结合位点的糖基化会影响AIV和宿主细胞的结合水平并且会使其毒力明显增加[9-10]。另有学者认为HA上的的糖基化位点不仅能够增强AIV的毒力，而且还与提高AIV在鸡上的适应性密切相关[11]。另一方面裂解位点附近的糖基化位点还可能影响到蛋白酶对HA基因前体蛋白的裂解，裂解位点一旦发生糖基化作用，该病毒的毒力就可能增强[12]。本实验所有病毒株均出现了P295S变异，并且该位点靠近裂解位点，这很可能会影响病毒的抗原性和裂解活性。

表1 H9N2亚型禽流感病毒HA基因关键氨基酸位点比对Table 1Comparison of am ino acid sequences of HA gene of representative chicken H9N2viruses

表2 红细胞法检测病毒受体结合类型Table 2Receptor binding specificity of the different viruses as determ ined by amodified CRBC HA assay

一般认为HA蛋白受体部位上第216位氨基酸若为亮氨酸(L)，则其识别SAα2,6Gal；若为谷氨酰胺(Q)，则识别SAα2,3Gal；若为蛋氨酸(M)，则同时识别两种受体。本研究表明我国北方流行的家禽源H9N2AIV同时具备α-2,3唾液酸和α-2,6唾液酸受体结合特性，这种受体结合特性的改变增加了AIV感染哺乳动物的可能性，进而为产生禽源、哺乳动物源的新型提供了可能。

目前国内对H9N2亚型的防控主要采用灭活苗免疫策略，但在宿主长期高免疫选择压力下，病毒基因会通过发生频繁突变以逃避宿主免疫系统监控，这是当前免疫失败的主要原因。因此，有必要对我国的H9N2AIV进行持续监测，以了解我国流行的H9N2病毒的变异情况，为指导禽流感疫情防控以及筛选疫苗病毒株提供依据。

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