十二指肠钩虫和美洲钩虫鉴定方法研究进展

王旗 汪天平*

钩虫是一种土源性线虫，虫卵随患者或带虫者排出的粪便在外界适宜的环境下发育成感染性的丝状蚴，通过与人体皮肤接触后而侵入人体完成感染。两种钩虫的生活史基本相似，发育过程包括虫卵、杆状蚴、丝状蚴、成虫。从感染性的幼虫侵入皮肤到成虫产卵，一般约需要5～7周。每年5～10月份是钩虫感染的高发季节，钩虫的易感人群主要为经常与泥土、农作物接触的农民。钩虫病的流行与当地的生产方式、生活方式，自然环境等多种因素有关[1]。本病主要存在于热带和亚热带经济欠发达的地区，被WHO列为被忽视的17种热带病之一[2]。2014～2016年，全国人体重点寄生虫病现状调查显示，我国的钩虫感染率约为1.12%[3]，两种钩虫在我国地域分布有一定差异，南方以美洲钩虫为主，北方以十二指肠钩虫为主，其中混合感染较为普遍，主要存在于南北交界处[1]。两种钩虫对驱虫药的敏感性也有一定的差异，阿苯达唑对十二指肠钩虫的治疗效果要优于美洲钩虫[4,5]，而三苯双脒对美洲钩虫的治疗效果要优于十二指肠钩虫[6]。因此，进行感染人体的两种主要钩虫的虫种鉴定，对钩虫病的治疗、防治具有十分重要的意义。

一、病原形态学鉴定

1.虫卵

钩虫卵椭圆形，卵壳薄，无色透明，卵壳与卵细胞之间空隙明显。从粪便中查到钩虫卵，是钩虫病确诊的主要依据，常用的方法有直接涂片法、饱和盐水浮聚法和改良加藤涂片法，目前在流行病学调查和实验室诊断中，改良加藤法应用最为普遍[7]。但是十二指肠钩虫和美洲钩虫虫卵形态相似，病原形态学检测不易区别[7]。

2.幼虫

将带有钩虫卵的粪便通过试管滤纸培养法，经过5～7 d两种钩虫均能孵育出感染性的丝状蚴[8]，此阶段钩蚴形态通过镜检可进行虫种鉴定。在低倍镜(×100)下，十二指肠钩蚴虫体细长，口矛不易见到，尾部鞘膜横纹看不清；而美洲钩蚴虫体短粗，口矛易见，呈黑色短杆状，尾部鞘膜横纹可见[9]。高倍镜(×400)下十二指肠钩蚴口矛透明管状，鞘膜横纹少数可见，但不如美洲钩蚴清楚；美洲钩蚴口矛高倍镜下更加清晰，黑色粗杆状，尾部鞘膜横纹清晰明显[9]。此种方法耗时，费力，需要经验丰富的病原学专业技术人员能够胜任。

3.成虫

两种钩虫成虫虫体形态区别最为明显，成虫主要通过内镜检查或给患者驱虫治疗后从粪便获取。在解剖镜下观察，十二指肠钩虫头尾向背部弯曲，虫体呈“C”形，口囊处有2对钩齿，背辐肋远端分2支，每支分3小支，交合刺呈长鬃状，末端分开，有尾刺；美洲钩虫头尾分别向背部和腹部弯曲，虫体呈“S”形，口囊处有1对板齿，背辐肋基部分2支，每支再分2小支，交合刺合并成一刺，末端呈倒钩状，没有尾刺[7]。

4.内镜检查

近几年，临床上关于内镜检查确诊出钩虫感染的病例报道经常出现。临床上用于检出钩虫病常用的内镜包括胃镜、结肠镜、双气囊小肠镜、胶囊内镜等。内镜下虫体呈淡红色，半透明，体长约1 cm，通过钩齿或板齿咬附于肠粘膜上，形成散在性的出血点及小溃疡[10,11]。王声旺等[12]通过对12例患者进行胃镜检查，胃十二指肠均未发现钩虫，排除上消化道疾病出血的可能。所有病例进行结肠镜检查，其中9例病患首次检出钩虫，3例患者首次未检出钩虫，但在做肠息肉治疗时发现钩虫。李保安等[13]报道肠镜检出直肠钩虫感染1例，在行息肉手术后反复观察，见活体寄生虫1条咬附于直肠粘膜，取出送检，经检验科确诊为十二指肠钩虫。Kshaunish等[14]对3例临床表现为黑便的患者进行胃肠镜检查未见原发病灶，通过双气囊小肠镜检查，确诊为钩虫感染。刘鑫等[15]通过对65例行双气囊小肠镜检查的可疑小肠病变患者临床资料进行回顾性分析发现，有两例患者分别在空肠和回肠部位检出钩虫。付唆林等[16]通过对1例反复脐周隐痛伴黑便4年的患者行双气囊小肠镜检查，在空肠中下段发现多条活动游走的钩虫虫体。赵治彬等[17]对152例不明原因消化道出血行胶囊内镜检查的患者进行回顾性分析，发现有钩虫病1例。陈敏佳等[18]通过使用胶囊内镜能够清楚的观察钩虫虫体形态，肠内活动及肠壁被咬附的创面。常江等[19]使用胶囊内镜发现十二指肠钩虫致消化道大出血病患1例，空肠上段见数条咬附着的钩虫，局部肠粘膜充血伴散在出血病灶。Christodoulou等[20]也报道了1例不明原因的消化道出血，后经胶囊内镜诊断为钩虫病的患者。唐君瑞[21]通过对10例经胶囊内镜诊断为小肠钩虫病患者的临床资料进行回顾性分析，5例虫体寄生于空肠，5例空肠回肠均有寄生。内镜检查是临床上钩虫病诊断重要的辅助工具，鉴别虫种需要临床医师具备一定的病原学专业技能，对人员和设备要求比较高，不足之处在于，内镜检查是一种侵入性操作，患者依从性，适应性较差[22]。

二、免疫学检测

1.免疫应答水平变化

钩虫入侵宿主后并在宿主体内移行，诱导宿主产生保护性免疫应答，宿主体内重要的效应细胞，以及体液免疫产生一系列特异性的抗体都会显著增加，主要表现为虫体发育迟缓、存活数量的减少，以及成虫生殖能力下降[23]。细胞免疫方面，Timothy等[24]发现小鼠经皮感染美洲钩虫后，白细胞显著增多，感染10 d达到高峰，认为白细胞增多与幼虫移行有关。Pritchard等[25]研究发现宿主感染美洲钩虫后嗜酸性粒细胞与虫荷呈显著负相关性，当再次感染后与IgE水平呈正相关性，因此认为美洲钩虫感染后Th2细胞可以产生保护性免疫应答。在体液免疫方面，王伟业等[26]发现小鼠感染十二指肠钩虫后，7 d血清出现抗体，15～30 d抗体水平达到高峰，45 d后抗体水平下降；小鼠感染美洲钩虫5 d血清中能检出抗体，10 d达到高峰，15 d后抗体水平下降。结果表明美洲钩虫抗体血清中出现及达到高峰时间较十二指肠钩虫早，而十二指肠钩虫血清抗体持续时间较美洲钩虫长。Labiana等[27]发现美洲钩虫感染率随年龄上升的趋势比十二指肠钩虫明显，两种钩虫混合感染的地区，儿童阶段感染率表现相对平缓。

2.酶联免疫吸附试验(ELISA)

ELISA用于测定抗原或抗体，包括三个主要试剂：固相抗原或抗体；酶标抗原或抗体；酶反应底物。王伟业等[26]用美洲钩虫和十二指肠钩虫的幼虫及成虫制备可溶性抗原，应用ELISA法检测感染宿主血清IgG抗体的变化，结果发现成虫抗原的敏感性和特异性均高于幼虫。Prichard DI等[28]发现相对分子量(Mr)在(28～33)×103的抗原组分为美洲钩虫所特有，与其他蠕虫鉴别时敏感性很高。Prichard等[25]在1988～1990年分别在治疗前后两次对新几内亚Kebasob的202名村民采集血清，用ELISA法检测抗美洲钩虫ES抗原的血清抗体水平，发现IgE水平和美洲钩虫的生殖力、虫荷具有负相关性。

3.免疫层析试纸条法

免疫层析试纸条法是一种固相免疫测定技术，原理与ELISA相似，最大的特点是不需要仪器设备，易操作，检测快速，最常见的是免疫胶体金技术。石锋等[29]以美洲钩虫成虫的可溶性抗原作为包被抗原，用胶体金标记SPG作为检测探针，成功建立了检测美洲钩虫病特异抗体的免疫胶体金试纸条，该试纸条检测美洲钩虫病人血清敏感性为88.4%，特异性达到94.9%，同时进行ELISA法检测，二者在敏感性和特异性方面无显著差异。

4.免疫沉淀和免疫印迹法

Carr等[30]制备美洲钩虫成虫排泄分泌抗原，通过免疫沉淀法进行检测发现，受美洲钩虫感染者血清对15×103、13×103、33×103、44×103、46×103抗原组分可发生沉淀反应。免疫印记法检测受美洲钩虫感染的动物血清，结果发现可识别包括上述6种抗原组分在内的至少15个虫体抗原组分。其中33×103抗原组分为美洲钩虫所特有，十二指肠钩虫无此抗原。闻礼永等[31]通过SDS-PAGE和免疫印记技术对采集的十二指肠钩虫第三期幼虫和成虫的可溶性蛋白组分以及其免疫反应进行研究。幼虫可溶性蛋白组分(Ad-L3-Ag)和成虫可溶性蛋白组分(Ad-A-Ag)进行免疫印记反应结果显示，十二指肠钩虫幼虫特异性抗原组分为41×103，成虫特异性抗原组分为55×103。

5.SDS-PAGE

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)主要用于蛋白和小片段核酸的分离。闻礼永等[31]通过SDS-PAGE电泳发现，十二指肠钩虫幼虫蛋白区带为21条，成虫蛋白区带19条。Prichard等[28]通过SDS-PAGE发现所有钩虫均含有(14～20)×103共同抗原组分，其中17×103为美洲钩虫所特有的抗原组分，具有种特异性。

三、分子生物学检测

近几年，分子生物学技术的快速发展和广泛应用，改变了钩虫传统鉴定方法的局限性，具有高敏感性和高特异性的优点。目前文献报道常见的分子生物学检测技术包括常规PCR、巢式PCR 与半巢式PCR、RT-PCR和HRM、LAMP技术、SSCP和PCR-RFLP等。

1.常规PCR

郑琪等[32]根据NCBI数据库中美洲钩虫和十二指肠钩虫mtDNA的CO1基因序列分别设计出两条PCR扩增引物，对收集五个省份的钩虫成虫CO1基因进行PCR扩增，结果显示以美洲钩虫DNA为模板扩增出一条500bp左右的条带，十二指肠钩虫DNA为模板进行扩增得到一条长700bp左右的条带，然后进行序列比对和特异性检验，成功构建了美洲钩虫和十二指肠钩虫虫种鉴定的PCR检测方法。Phosuk等[33]通过体外培养第三期钩蚴，PCR扩增其核糖体DNA的全部5.8S、部分ITS-1和部分ITS-2序列，然后对PCR产物测序并比对，成功对美洲钩虫和十二指肠钩虫进行虫种鉴定。

2.巢式PCR与半巢式PCR

巢式PCR又称套式PCR，和常规PCR有所不同，巢式PCR需要两对引物才能得到目的基因，第一对引物和常规PCR类似，第二对引物为巢式引物，需要用第一对引物PCR扩增的产物为模板再扩增，经过两轮PCR才能获得的靶基因。半巢式PCR与巢式PCR基本相同，不同之处在于有一条外侧引物为两轮PCR共用引物。半巢式PCR比常规PCR具有更高的特异性和敏感性，在模板DNA含量很低时，也能很大程度提高DNA的产量[34]。刘晓辉[35]通过构建套式PCR技术对人粪中存在的美洲钩虫和锡兰钩虫进行分类鉴定，选取39份钩虫镜检阳性的粪便标本和21份钩虫镜检阴性的样本，经过套式PCR扩增，对产物进行序列比对，最终确定有1份与锡兰钩虫的核糖体基因相似度在99%，49份与美洲钩虫核糖体基因相似度在99%，达到了对美洲钩虫和锡兰钩虫的虫种鉴定。De Gruijter等[36]利用半巢式PCR检测人粪便中的十二指肠钩虫，与Verweij等[37]用半巢式PCR检测人粪中的美洲钩虫作比较，进一步证实了用两种钩虫特异性的引物进行PCR扩增，可以得到不同的目的基因，美洲钩虫电泳条带大小约250bp，十二指肠钩虫约130bp，可以作为两种钩虫分类鉴定的方法。

3.RT-PCR和HRM

实时荧光定量PCR(RT-PCR)可以对整个PCR反应过程实时监测，通过反应曲线对核酸进行定量分析。Wang等[38,39]通过钩蚴培养得到美洲钩虫幼虫，提取幼虫基因组DNA，对美洲钩虫ITS-2序列进行PCR扩增，对产物纯化鉴定，作为标准模板建立了检测美洲钩虫的RT-PCR标准曲线。高分辨率溶解曲线(HRM)分析技术是在RT-PCR的基础上发展起来的基因检测新技术，可以实时监测荧光染料与双链DNA从结合到释放荧光强度的变化。对荧光强度和时间轴曲线分析进而对PCR产物进行鉴别。Ngui等[40]采用RT-PCR和HRM分析技术结合，以rDNA的ITS-2序列为靶基因，对人粪样中5种钩虫进行RT-PCR检测和溶解曲线分析，结果发现美洲钩虫的HRM在不同温度区间出现2个峰值，另外4种钩虫各在不同的温度范围出现一个峰值。

4.LAMP技术

环介导等温扩增(LAMP)技术是日本学者Notomi在2000年发明的一种新的DNA扩增技术，LAMP方法最大的特点是操作简便，成本低，核酸扩增不需要PCR仪器，只需要水浴锅就可以进行。Mugambi等[41]构建了用于检测粪便中美洲钩虫的LAMP诊断方法，对美洲钩虫的ITS-2序列设计了4个引物，LAMP法提取DNA，反应条件为63℃水浴1 h。结果显示该引物只能扩增出美洲钩虫DNA片段，特异性为100%，因此该LAMP诊断方法可以对人粪中美洲钩虫进行鉴别。

5.SSCP和PCR-RFLP

单链构象多态性(SSCP)其原理是碱基突变时，单链DNA构象发生改变，使其在凝胶电泳条带上出现差异，呈多态性。Gasser等[42]通过核糖体DNA的ITS序列建立了PCR-SSCP技术，对PCR产物进行变性后凝胶电泳，结果证实可以鉴定所有的钩虫虫种。限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)技术,其原理是先用PCR扩增相应的DNA片断，而后进行限制性内切酶切反应，电泳后根据限制性图谱来分析序列间的差异，最终能够达到虫种鉴定的目的。George等[43]利用半巢式PCR-RFLP方法对印度一个部落社区儿童进行钩虫病调查：41名儿童出现不同程度钩虫感染，美洲钩虫占95%，十二指肠钩虫15%，锡兰钩虫5%。

四、小结

目前关于感染人体的两种主要钩虫的分类鉴定检测技术研究众多，本文就近几年文献报道的最新分类鉴定方法进行了综述。病原形态学鉴定方法操作费时费力，漏检率高，仅在成虫和丝状蚴阶段可以进行虫种鉴定，而且需要检查者具备丰富的经验，但此法却是检测钩虫和虫种鉴别的最可靠标准。钩虫虫种鉴定的免疫学诊断方法敏感性高，可以弥补病原形态检测方法的不足，局限性在于抗原特异性不强，暂时没有得到大规模应用，多用于确诊的辅助手段。近几年，分子生物学技术发展迅速，被广泛应用到钩虫病的诊断以及虫种的鉴定，具有高敏感性，高特异性的优点，成为今后钩虫病研究的热点检测方法，但是需要相关仪器设备和专业技术人员的分子生物学技能，目前在基层应用受到一定限制。三种检测方法都存在一定的优缺点，随着科技的发展以及现代医学的需要，分子生物学检测对感染人体钩虫的鉴定应用前景更加广阔。