白地霉提取凝血质对衰老模型大鼠血栓形成的诊断

刘诗音 王 莘 (吉林农业大学生命科学院，吉林 长春 130118)

血栓形成倾向与血液中凝血质的含量相关，临床研究亦发现，老年血栓病患者血浆凝血质浓度明显增高，且抗原水平和活性明显高于正常人〔1〕，血液中凝血质含量是动脉血栓形成的关键环节〔2〕。在血液中加入凝血质，通过计算凝血时间诊断血栓形成，方法简单。目前只有在单核细胞中细菌脂多糖类人工诱导合成凝血质。本文利用白地霉发酵提取纯化凝血质，对预防、诊断血栓疾病提供了新的药物来源途径。

1 材料与方法

1.1 材料 白地霉:吉林农业大学生命科学学院生物工程实验室提供。SD大鼠:体重250～280 g，30只，雌雄各半。由长春市生物制品研究所提供。

1.2 试剂 D-半乳糖，FeCl3，Sephadex G-200。

1.3 方法

1.3.1 白地霉发酵提取纯化凝血质 PDA培养基，摇瓶发酵，收集菌丝体，冻干，－4℃冰箱中保藏。白地霉菌丝体(乙醇浸提，先38℃ ～50℃，后30℃以下)，提取液浓缩 (硫酸钠脱水)，膏状物 (乙醚提取)，乙醚滤液 (浓缩)，浓缩液 (丙酮沉淀)，沉淀物 (凝血质粗制品)Sephadex G-200纯化得凝血质纯品。

1.3.2 动物实验 将20只 SD大鼠，每天予 D-半乳糖0.125 g/kg皮下注射共40 d构建大鼠衰老模型。之后分成年老空白组及年老血栓诱导组，每组雌雄各5只。血栓诱导组用5%FeCl3溶液诱导血栓生成。24 h后，将30只大鼠分为青壮组，年老组及年老血栓诱导组分别用断尾取血方法取血一大滴滴到载玻片上，迅速滴加5 μl、0.1 g/ml浓度凝血质溶液，倾斜载玻片计时。用针尖每5 s划一次血液，当出现丝状物，计时停止，对比各组凝血时间。

2 结果

2.1 凝血质纯化 白地霉发酵提取的粗蛋白经纯化后，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，纯化蛋白质与marker在同一条带上，分子量为47 kD左右。见图1。

图1 凝血质纯化蛋白SDS-PAGE电泳图

2.2 各组体外凝血时间 青壮组最高凝血时间为41 s，最低凝血时间为37s，平均凝血时间为39 s。老年组最高凝血时间为39 s，最低凝血时间为29 s，平均凝血时间为34 s;其中4只大鼠凝血时间与其他大鼠凝血时间有较大差距，分别为29、30、30、29 s，平均凝血时间为29 s、年老诱导血栓组最高凝血时间为27 s，最低凝血时间为24 s，平均凝血时间为25 s。

2.3 观察大鼠体内血栓的形成 青壮组经观察1个月，体内均未出现血栓;老年组，凝血时间较低的4只大鼠3 d后体内出现血栓;年老诱导血栓组24 h内10只大鼠均因血栓死亡。

3 讨论

凝血质为胞内蛋白，在提取纯化过程中，要保证其酶活性，严格控制反应温度。因为杂蛋白较多，在提取纯化过程中，需要较高的条件。

研究衰老机制、老年病需要可靠的衰老模型。复制衰老模型的依据是目前公认的几种衰老学说。D-半乳糖致衰老模型是我国学者基于衰老的代谢学说而复制的衰老模型，该模型系在一定的时间内给动物连续注射D-半乳糖，使其细胞内半乳糖浓度增高，在醛糖还原酶催化下，还原成半乳糖醇，后者不能被细胞进一步代谢而堆积在细胞内，影响正常渗透压，导致细胞肿胀，功能障碍，代谢紊乱，最终机体衰老〔3〕。

动物血栓模型的制作基本遵循Virchow提出的血栓形成的经典原理。对血液进行体外凝血实验，检测凝血时间，可根据凝血时间诊断是否会有血栓生成，为今后预防、诊断血栓疾病提供了新的药物来源途径。

1 Banai S，Gertz SD.Tissue factor as therapeutic target in coronary syndromes〔J〕.Am J Cardiol，2001;87:763-5.

2 Moreno PR，Palacios IF，Leon MN，et al.Histopathologic comparison of human coronary in-stent and post-balloon angioplasty restenotic tissue〔J〕.Am J Cardiol，1999;84:462-6.

3 Song X，Bao M，Li D.Advanced glycation in D-galactose induced mouseaging model〔J〕.Mech Ageing Dev，1999;108(3):239-51.