引起牛奶腐败的嗜热芽孢杆菌的检测及对牛奶酸败速度的影响

付红蕾，李 彦，蒋 磊，庄燕飞，常维山

（1.青岛市饲料兽药检测站，山东青岛 266071；2.山东农业大学动物科技学院 预防兽医系，山东泰安 271018）

牛奶作为日常饮食必需品早已经进入人们的日常生活，但是牛奶营养丰富，是天然的培养基，极易腐败变质[1]。引起牛奶腐败变质的原因很多，商品化的牛奶虽经过巴氏消毒，但是不能杀灭所有的微生物

[2-3]，一些嗜热性的芽孢杆菌得以存活，最终成为引起牛奶变质的一项原因。本试验通过分离培养，显微镜检，初步推测牛奶中的嗜热性芽孢杆菌多数为枯草芽孢杆菌，并用平板菌落计数法[4-5]对乳样进行细菌总数计数。本试验还对不同稀释浓度煮沸牛乳对高压灭菌牛乳造成腐败进行测定，验证经煮沸过的牛乳依然可以造成高压灭菌牛乳腐败。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 牛乳及培养基

牛乳：取自某品牌纯乳制品；LB培养基：蛋白胨 2 g，酵母浸出物 1 g，NaCl 2 g，去离子水200 mL。

1.1.2 主要仪器和试剂

显微镜，电子天平，37 ℃培养箱，水浴锅。

1.2 实验方法

1.2.1 乳样的采集

试验用乳取自山东某品牌纯乳制品，该牛乳已经巴氏消毒处理。试验中一组牛乳再经过80 ℃10 min，37 ℃培养过夜，为乳样1；另一组牛乳经高温湿热灭菌处理，为乳样2。试验均在超净台中进行，以免污染。

1.2.2 乳样内细菌的分离和染色

1.2.2.1 细菌的分离

取80 ℃处理过的乳样1，在LB板上划线，然后37 ℃培养过夜。

1.2.2.2 细菌的染色取培养出的细菌进行革兰氏染色，然后进行镜检。

1.2.3 细菌总数的测定（平板菌落计数法）

1.2.3.1 乳样的稀释

取六只试管，依次编号为1、2、3、4、5、6，然后每只试管加入9 mL生理盐水灭菌待用。然后取1 mL奶样加入到1号管，摇匀。然后另取一支移液管，从1号管中取1 mL乳样加入2号管中，依此类推一直稀释到6号管。

1.2.3.2 样品稀释与接种

首先倒平板，在超净台中吹干平皿上的水，待凝固好之后进行平板涂布，用移液器分别从1、2、3、4、5、6号试管中取出25 μL样品滴在平皿中央。

1.2.3.3 平板培养

静置待乳样吸收后将六块平皿倒置放入37 ℃培养箱培养12 h，分别在8、9、10、11、12 h的时候计数。

1.2.3.4 菌落计数

分别在8～12 h每隔1 h进行一次计数，细菌总数=菌落数量×稀释倍数。

1.2.4 不同稀释浓度乳样对牛乳腐败的测定

1.2.4.1 乳样的准备

由1.2.1中，取出乳样2，试管分别编号A、B、C、D、E、F，然后依次抽取1～6号样中1 mL加入到A～F号试管。整个操作过程都必须在超净台中完成。

1.2.4.2 样品的培养

将六只试管放入37 ℃培养箱培养，每隔段时间进行观察。

2 结果与分析

2.1 乳样1 LB平板划线分离结果

经平板划线培养12 h，平板上长出两种菌落，一种为形状不规则的菌落，为半透明的奶油色，干燥，称为细菌1。另一种表面湿润，称为细菌2。两种菌落的比例大约为7:1，第一种占多数。

2.2 所分离细菌革兰氏染色后镜检结果

通过图1可以看出此菌为革兰氏阳性菌，为杆菌。通过图2可以看出此菌同样为革兰氏阳性菌，为球杆菌。

2.3 乳样1中的细菌总数

进行平板计数发现，稀释10倍的平板8 h时已经长成一个大的菌苔取消计数，8～12 h每隔1 h计数一次，结果显示计数差别并不大，所得数据见表1。由表1可以得出，乳样1中细菌总数应该在1×106这个数量级上。

2.4 不同稀释浓度乳样1对牛乳（乳样2）腐败的测定结果

表1 不同稀释度下乳样中的细菌总数

37 ℃培养36 h候1，2号管出现明显的变质现象，3～6号管没有明显的变化。

3 讨论

通过上述实验，我们由菌落的形态，镜检结果，推测细菌1为嗜热枯草芽孢杆菌。对煮沸的牛乳乳样进行计数，发现嗜热芽孢杆菌的每毫升总数达到106这个数量级，而且将细菌1接种高压灭过菌的乳样，在37 ℃情况下36小时就可以使牛奶变质。所以可以证明普通商品化的牛乳虽然经过了巴氏消毒法，但是其并不能杀灭牛乳里面的所有的微生物。如嗜热芽孢杆菌就很难杀死，其可以引起灭菌牛乳的腐败。这也证明了常温下牛奶的保质期较短，所以商品化的纯牛奶也要尽量保存在低温环境中。

牛乳中存在的枯草芽孢杆菌很有可能就是被奶牛的日常饲料所污染的[6]。此外针对细菌2是什么菌仍值得研究。细菌1可以引起牛乳的腐败，那么是不是有某种杀菌方法可以杀灭此种细菌，从而延长商品牛奶的保质期，值得继续研究探索。

[1]麦志杰，徐海涛，赵静，等.检测牛奶变质的研究[J].中国乳品工业，2011，39（3）：24-25.

[2]韦同.消毒乳与超高温灭菌乳的加工工艺和特性的比较[J].广西畜牧兽医，2004， 20（3）：128-129.

[3]孙凯，吕礼良，杨瑾，等.鲜奶的检测与消毒[J].吉林畜牧兽医，2007，09（28）：57-58.

[4]杨玉民，刘旭昊，唐琳，等.伊河河水中细菌总数和大肠菌群数的检测研究[J].宁夏农林科技，2011，52（7）：92-93.

[5]周德庆.微生物实验教程[M].北京：高等教育出版社，2006：320-327.

[6]胡红莲，张博，高民.枯草芽孢杆菌型微生态制剂在奶牛日粮中应用效果试验[J].饲料工业，2011，32（18）：52-55.