快速导流杂交基因芯片法检测人乳头瘤病毒的实验观察

焦淑静

流行病学研究证实人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)感染是女性宫颈上皮内瘤变(Cervical intraepithelial neoplasia，CIN)和宫颈癌的主要病因，对HPV感染的检测和分型是处理宫颈病变的重要依据[1]。HPV的不同型别引起细胞病理的类型改变不同，因此，准确的基因分型，及时明确患者感染HPV的基因型别对感染的治疗、宫颈病变的预防及流行状况的调查均有重要的意义[2]。我们采用核酸分子快速导流杂交基因芯片分型技术(HybrMax法)对我院妇科门诊796例妇女进行了HPV感染的分型检测，实验结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2009年4月至2012年3月在我院妇科门诊就诊患者796例，采用HybrMax法检测人乳头瘤病毒并进行基因分型。随机选取502例，年龄21～53岁，平均年龄(36±11.5)岁，其中宫颈细胞学检查正常者116例，细胞学异常者386例。对细胞学检查异常者在阴道镜下行宫颈多点活检进一步作病理学检查，诊断标准采用2001年国际癌协会TBS诊断系统。包括:宫颈慢性炎症(炎症组)173例，宫颈上皮内瘤变Ⅰ级(CINⅠ组)92例，上皮内瘤变Ⅱ级(CINⅡ组)52例，上皮内瘤变Ⅲ级(CINⅢ组)44例，宫颈癌组25例，所有标本采集和诊治过程均经就诊者本人同意。

1.2 实验方法 HPV分型检测的标本取样步骤和要求按宫颈细胞学取材常规进行，标本放置在专用样本收集管内，4℃保存两周内检测。导流杂交基因芯片HPV分型试剂盒由凯普生物化学有限公司提供，能够检测21种基因型;PCR扩增用扩增仪由厦门安普利生物医学有限公司提供。样本检测时严格按操作程序进行DNA提取、扩增、快速导流杂交，肉眼对样本结果进行判读。

1.3 统计学方法 应用SPSS10.0软件进行统计分析，组间比较用t检验，率的比较采用卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 应用导流杂交基因芯片法检测796例患者HPV结果796例患者标本中，HPV基因检测阳性率为29.15%(232/796)。

2.2 导流杂交基因芯片与病理组织学检查结果的比对随机选取的502例患者样本中，基因芯片技术检测HPV基因分型阳性176例，阴性326例。阴性病例以正常细胞学及低度以下病变(慢性炎症和CINⅠ)为主，占90.49%，高度病变(CINⅡ、CINⅢ)及宫颈癌占9.5%。阳性病例中随着病变程度增高，HPV感染率亦逐渐升高，各组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)。以病理组织学结果为标准，导流杂交基因芯片技术诊断宫颈癌的敏感性为96%，特异性为68.13%，阳性预测值为13.63%，阴性预测值为99.69%，结果见表1。

2.3 不同组别患者导流杂交基因芯片检测HPV的基因型分布情况176例阳性标本中检测出14种基因型，其中高危基因型10种，低危基因型4种。HPV基因型感染率由高到低为:HPV-16(22.7%)、HPV-58(8.5%)、HPV-52(8.5%)、HPV-18(8.0%)、HPV-33(7.4%)、CP8304(6.3%)、HPV-53(5.7%)、HPV-31(5.1%)、HPV-11(5.1%)、HPV-68(4.5%)、HPV-42(4.5%)、HPV-59(3.9%)、HPV-39(3.4%)、HPV-44(2.8%)。前七位均为高危基因型，统计显示宫颈癌组HPV高危基因型感染率为92%，明显高于炎症组和CIN组，差异有统计学意义(P＜0.05);HPV-16型感染率最高且与宫颈癌病变严重程度正相关(P＜0.01)。

2.4 不同组别患者导流杂交基因芯片检测HPV多重感染结果分析，各组均有多重感染的情况，随着病变程度的加重，多重感染率越高。其中单一感染率22.3%，双重感染率10.2%，三重感染率5.2%，四重感染率3.0%，各组感染率比较差异有统计学意义(P＜0.05)。结果见表2。

表1 502例标本依据病理组织学分组HybrMax法检测HPV结果(例，%)

表2 不同组别患者HPV多重感染结果表(例，%)

3 讨论

流行病学调查证实，高危型HPV感染是子宫颈癌和子宫颈上皮内瘤变高发的主要危险因素[3]。HPV感染的检测已成为预防、诊断和处理宫颈病变的重要依据，因此选择一种准确、快速、实用的HPV检测方法很有必要。目前，采用分子杂交技术(HC-Ⅱ法)和PCR定量检测HPV是主要的两种筛查方法。但传统的杂交技术操作繁杂，需时较长，易出现假阳性和假阴性，且不能判断多重感染，从而容易造成对患者病情的错误评估。导流杂交基因芯片技术(HybrMax法)可弥补上述缺陷，有学者报道传统的HC-Ⅱ法和HybrMax法的实验结果有很高的一致性[4]。

本文实验结果示，796例患者标本HPV感染阳性率为29.14%。所随机选取的502例标本中，HPV感染率为35.05%。细胞学检查正常患者标本中，HPV感染为12.06%。随着患者宫颈病变程度的加重，HPV感染率逐渐增高，慢性炎症组为23.69%，CINⅠ组为33.69%，CINⅡ组为59.61%，CINⅢ组为79.54%宫颈癌组为96.0%，各组间对比差异有统计学意义(P＜0.05)，证明HPV感染与CIN和宫颈癌的发生高度相关。有文献报道，HPV感染者只有在病毒靠自身免疫力无法清除并持续感染状态时才会引起宫颈病变。本组实验资料宫颈癌患者的特异性为68.13%，比郭东辉等报道的资料低，它可能与本组患者年龄结构、地区差别及样本量小有关。

HPV基因型的分布具有明显的地区差别，在宫颈癌患者中除HPV16外，HPV45、31、33较常见，多数亚洲国家的研究提示，HPV52、58 的感染率高于 HPV45、31、33，本组数据显示与其研究结果一致。本实验结果中HPV45的阳性率为零，亦无HPV35和43型，符合亚洲地区高危型HPV的流行病学调查结果。宫颈上皮内瘤变组(CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ组)中HPV52型、58型的阳性率高于HPV18型，而宫颈癌组HPV18亚型阳性率最高，提示感染HPV18型的患者可能更易致癌。近来有学者发现许多患者存在HPV混合性感染，但混合性感染的类型、作用以及对致病能力的影响尚无确切定论[5]。本文实验结果统计发现，高级别CIN病变患者中有较高的混合性感染，主要为HPV16/18型与31/33型的混合。176例HPV阳性患者标本中，18.4%为混合性感染，主要分布在宫颈上皮内瘤变和宫颈癌组，且与病变严重程度成正比;混合性感染与单一感染相比，两者宫颈上皮内病变发生率差异有统计学意义(P＜0.05)，说明多重HPV病毒亚型的混合性感染对宫颈慢性炎症、CIN和宫颈癌的发生与发展可能有累加和促进作用。

综上所述，采用导流杂交基因芯片技术对HPV感染者进行分型检测，并结合细胞学的检查，对宫颈癌的早期预防和治疗意义重大，也可作为无临床症状HPV感染者的疗效观察和随访检查手段。

[1]郎景和.迎接子宫颈癌预防的全球挑战与机遇.中华妇产科杂志，2002，37(3):129-131.

[2]陶萍萍，卞梅璐，欧华，等.导流杂交基因芯片技术在人乳头状瘤病毒检测中应用的研究.中华妇产科杂志，2006，41(1):43-47.

[3]陈占国，周武，许张晔，等.导流杂交方法检测人乳头状瘤病毒分型的临床应用 .中华医院感染学杂志，2008，18(9):1345-1348.

[4]乌兰娜，吴瑞芳，周艳秋，等.人乳头瘤病毒基因亚型与宫颈病变的关系.中国妇产科临床杂志，2005，6:346-350.

[5]薛耀华，何雪葵，张建明，等.高危型人乳头瘤病毒检测及其临床意义.广东医学，2005，26(2):178-179.