2型糖尿病患者尿足细胞的排泄及其相关因素

冯秋霞 程丽静 芦露 罗兰 白艳 李萍 季军 高政南

糖尿病肾病(DN)是糖尿病的常见并发症之一，但其发病机制是复杂的，目前尚不完全清楚。近年研究发现，肾脏的足细胞损伤在糖尿病肾病的发病机制及预后均具有重要的作用。在各种致病因素作用下，足突细胞损伤可能的机制包括足突消失、足细胞肥大、脱落、凋亡，或上皮细胞-间充质细胞转换，其中受损后脱落的足细胞可随尿液排泄[1-3]。本研究观察了2型糖尿病(T2DM)患者尿中足细胞数量的变化，研究其与血清C反应蛋白(CRP)的关系，以探讨糖尿病肾病患者足细胞脱落的机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 T2DM组:按照1999年WHO糖尿病诊断标准，收集我院2008～2010年门诊和住院的124例T2DM患者(内生肌酐清除率＞90 ml/min)，除外合并糖尿病急性并发症、大血管并发症、妊娠、感染、应激、外伤、恶性肿瘤、其他可能的肾脏病，以及曾服用血管紧张素转换酶抑制剂、他汀类降脂药、噻唑烷二酮类药物者，空腹血糖＜7.0 mmol/L，餐后2 h

血糖＜10.0 mmol/L，血压＜140/90 mm Hg。所有患者根据尿白蛋白排泄率(UAER)分为正常蛋白尿组(UAER ＜20μg/min，NA组)38例，微量白蛋白尿组(UAER 20～200μg/min，MA组)59例，大量蛋白尿组(UAER ＞200μg/min，CP组)27例。25名健康体检者作为正常对照组(NC组)。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂 小鼠抗人podocalyxin单克隆抗体，由美国密西根大学David B.Kershaw教授惠赠，FITC标记山羊抗小鼠抗体IgG购自北京中杉生物技术有限公司。

1.2.2 空腹血糖(FPG)、餐后2 h血糖(P2HBG)、胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、血肌酐(SCr)应用全自动生化仪进行检测;糖化血红蛋白(HbA1 c)测定采用金标法;UAER测定采用放免法;CRP检测采用免疫比浊法。

1.2.3 尿中足细胞观察及足细胞数量检测采用间接免疫荧光法。主要步骤如下:取新鲜中段尿液100 ml，以1200 r/min离心5 min。弃上清，取80μL尿沉渣甩片，室温干燥30 min。丙酮4℃固定10 min，自然干燥，以0.01PBS冲洗。置1%Triton-1005 min，羊血清蛋白封闭，室温30 min。小鼠抗人Podocalyxin单克隆抗体体积比1:20稀释，4℃过夜。FITC荧光标记山羊抗小鼠IgG体积比1:75稀释，37℃孵育30 min。碘化丙啶染核，甘油封片。荧光显微镜下观察，绿色荧光波长580 nm;每份标本低倍镜观察全片，高倍镜下确认胞膜呈绿色、胞核为红色的细胞为足细胞。由两位作者同时观察全片，记录完整足细胞的个数，并根据稀释倍数计算单位体积尿液的足细胞数。

1.3 统计学方法 所有数据应用SPSS14.0统计软件进行分析，计数资料采用χ检验，计量资料采用t检验。

2 结果

2.1 对照组和糖尿病各组的年龄、性别分布、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、体重指数(BMI)、TC、TG、FPG、P2 hBG、HbA1c两两比较无明显差别，见表1。

表1 各组的资料比较(±s)

表1 各组的资料比较(±s)

注:与 NC组比较，*P＜0.05，＊＊P＞0.05，;与 NA 组比较，△P＜0.05;与 MA 组比较，☆P＜0.05，◆P＜0.01。

25 38 59 27年龄(岁) 53.4±7.6 52.9±7.3 55.0±9.1 54.8±8.6性别(男/女) 11/14 20/18 28/31 14/13病程(年) 0 5.4±2.8 9.1±4.3△ 12.5±7.7☆SBP(mm Hg) 126.4±6.5 132.1±4.7 129.3±8.3 133.8±7.22 dBP(mm Hg) 79.5±8.7 76.3±10.1 80.5±6.9 82.4±9.4 BMI(kg/m2) 23.02±3.32 25.87±2.09 26.14±3.07 24.34±4.45 TC(mmol/L) 4.75±2.09 4.95±1.67 5.03±1.73 4.87±1.34 TG(mmol/L) 1.97±2.62 2.35±2.85 2.17±1.64 2.08±2.21 FPG(mmol/L) 4.85±0.93 5.16±1.32 5.39±0.68 5.64±1.07 P2hPG(mmol/L) 6.93±1.54 7.04±3.89 7.12±1.09 7.15±2.53 HbAl C(%) - 6.5±1.7 6.7±1.4 6.4±1.5 UAER(μg/min) 7.15±4.82 9.34±8.27* 83.52±42.93△ 437.69±214.73◆SCr(μmol/L) 53.51±9.23 51.79±8.43* 79.23±12.36△ 97.46±213.54☆CRP(mg/L) 1.03±1.22 2.34±1.67＊＊ 6.83±2.31△ 11.37±4.3☆足细胞数量(个/ml) 0.3±0.3 0.4±0.2＊＊ 2.4±0.9△ 6.3±2.5 NC NA MA CP例数(个)组别☆

2.2 与对照组相比，糖尿病正常蛋白尿组的血CRP、尿足细胞数量无明显升高(P＞0.05)。而糖尿病微量白蛋白尿组与正常蛋白尿组患者比较，大量蛋白尿组与微量白蛋白尿组比较，病程、UAER、SCr、CRP、尿足细胞数量均显著升高(P ＜0.05或P＜0.01)。

3 讨论

诊断糖尿病肾病的金标准是肾活检，但因为该方法具有创伤性而较少应用于日常临床工作。UAER是目前临床上评估糖尿病肾病最为常用的方法，但在合并感染、高蛋白饮食时容易受到干扰，无法真实地反映肾脏的病理改变。肾小球上皮细胞又称足细胞，是肾小球滤过屏障的重要结构。在糖尿病肾病患者，足细胞会受到损伤而发生凋亡和脱落[4，5]，最终排泄到尿液中。Podocalyxin是仅表达于足细胞的一种膜蛋白，故成为足细胞的标志性蛋白。应用抗podocalyxin的单克隆抗体对尿沉渣进行免疫荧光染色，是一种检测尿中足细胞的特异性方法[6]。Nakamura T[7]的研究表明，在伴有微量白蛋白尿和大量蛋白尿的DN患者尿中可检测出足细胞，且后者尿中足细胞数量明显多于前者。本研究通过间接免疫荧光染色方法，观察了T2DM患者尿中足细胞及其排泄的变化，结果发现T2DM患者尿中足细胞数量随UAER升高而增加，与Nakamura报道的结果一致。本研究还观察到正常蛋白尿的DM患者也有少量的足细胞排泄，但与正常对照组无显著性差异。国外曾有资料[8]表明足细胞的脱落可以早于尿蛋白的增加，与本研究的结果不同，可能与本研究的例数较少有关。由此可见，尿足细胞排泄较UAER可以更好地反映DN的病理改变，并与DN程度相关。本研究采用的尿足细胞检测方法直接反映了肾脏的病理损害，而且具有无创伤性的特点，比UAER更加抗干扰，比肾活检更易于临床广泛开展。

糖尿病肾病患者肾脏足细胞脱落的机制目前不十分清楚。2006年 Hotamisligil GS[9]首次提出了代谢性炎症的概念，这种慢性低度、代谢引发的炎症主要由营养物和代谢过剩所触发。随后尚有大量研究表明，炎症在糖尿病肾病的发病机制中也扮演着重要的角色[10，11]，而炎症因子CRP不仅是T2DM发病的强预测因子[12，13]，在DN患者也可见到CRP明显升高[14，15]。本研究中 DM 患者的血 CRP水平不仅与UAER相关，也与其尿中足细胞的数量相关。这一结果提示DN患者足细胞的损伤及脱落可能与代谢性炎症有关。已有研究发现CRP可引起局部炎症，促进IL-6和黏附因子等的释放，上调白细胞抗原表达，增加自由基和蛋白水解酶，最终导致肾小球结构和功能改变[16]。这些机制可能参与并导致了足细胞的脱落。

本研究证实了DN患者尿中足细胞排泄数量增多，其数量与肾病的程度有关，而且与炎症因子CRP的变化一致。提示慢性炎症反应可能是DN患者足细胞脱落的原因之一，但确切的机制尚需进一步研究。尿足细胞数量的测定有可能成为评估糖尿病肾病的新手段。

图1 免疫荧光染色显示尿中足细胞

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