蛋白酶水解马氏珠母贝肉对镉解离效果的研究

蒲利民 吴晓萍 王 涛 毛伟杰

（1.广东省水产品加工与安全重点实验室，广东 湛江 524088；2.广东普通高等学校水产品深加工重点实验室，广东 湛江 524088；3.国家贝类加工技术研发分中心（湛江），广东 湛江 524088；4.广东海洋大学食品科技学院，广东 湛江 524088）

镉是一种对人类健康有害的有毒重金属［1，2］。随着中国工业化的快速发展，大量的重金属以多种方式进入海洋，由此造成水环境中的重金属镉的含量不断增加［3－5］。双壳贝类属于滤食性生物，在滤食饵料生物的同时，容易将水中有害物质吸入体内，研究［6，7］表明，贝类对镉的富集系数可高达105～106，很多地区的贝类镉的含量严重超标。

马氏珠母贝 （Pinctada martensii）是生产珍珠的主要母贝，也是一种优质的蛋白质源［8］，采珠后除可做饲料等外，还可以进行深加工，制备诸如贝肉罐头、蛋白质营养液等营养品以及提取功能活性成分如糖胺聚糖等以提高利用率和附加值［9］。但马氏珠母贝的重金属镉的含量很高，且在贝肉的深加工产品中由于浓缩等工艺会导致镉的含量进一步增大［10］。马氏珠母贝体内过量的镉严重影响了它的食用安全性和经济价值。因此探索有效的去除其体内镉的方法具有重要意义。研究［11］表明，贝类中的镉主要与大分子蛋白质结合，若想去除贝类中镉，需先将镉从蛋白质等大分子中解离出来。

本试验针对马氏珠母贝肉中镉含量超标等问题，利用蛋白酶对马氏珠母贝肉水解，探讨水解条件对镉的解离效果，优选出适用于马氏珠母贝肉水解的蛋白酶；分别进行单一酶解试验和复合酶解试验，并优化条件，比较不同酶解技术对马氏贝肉中镉的解离效果；采用响应面设计方案，建立动态数学模型，优选出对马氏珠母贝肉具有良好水解效果和镉解离效果的蛋白酶及其酶解参数。为下一步贝类镉的脱除奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

马氏珠母贝：购于湛江市徐闻县流沙湾珍珠养殖场，将贝去壳取其全脏器用超纯水洗净，沥干后匀浆，－18℃冻藏备用；

木瓜蛋白酶：3 500U／mg，广西南宁市庞博生物工程有限公司；

胰蛋白酶：250U／mg，美国Sigma公司；

中性蛋白酶：6万U／mg，美国Sigma公司；

枯草杆菌蛋白酶：4 000U／mg，广西南宁市庞博生物工程有限公司；

胃蛋白酶：3 000U／mg，美国Sigma公司。

甲醛、盐酸、硝酸、硫酸、高氯酸：优级纯，广州化学试剂二厂；

氢氧化钠：分析纯，广州化学试剂二厂；

镉标准GBW08612（1.0mg）：国家标准物质研究中心；

试验用水：超纯水，本实验室自制。

1.1.2 主要仪器设备

电热恒温水浴锅：HHS型，上海博讯实业有限公司；

pH酸度计：PHSJ－4A型，上海精密科学仪器有限公司；

恒温磁力搅拌器：JB－2型，常州国华电器有限公司；

台式离心机：TD5型，长沙英泰仪器有限公司；

原子吸收光谱仪：Z－5000型，日本日立公司；

超纯水系统：Milli－Q Academic A10型，美国 Millipore

公司。

1.2 方法

1.2.1 总氮、氨基态氮和镉含量的测定

（1）总氮含量的测定：采用凯氏定氮法［12］。

（2）氨基态氮含量的测定：采用甲醛滴定法［13］。

（3）镉含量的测定：采用石墨炉原子吸收光谱法［14］。

1.2.2 蛋白酶筛选 选用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、精制中性蛋白酶、胃蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶5种蛋白酶对马氏珠母贝肉进行酶解试验，以镉解离度为指标，比较5种蛋白酶水解马氏珠母贝肉对镉解离度影响的大小。分别在液固比4∶1（V∶m），加酶量4 500U／g，水解时间5h，最适温度和最适pH条件下，进行水解，测定水解液的镉含量，按式（1）计算镉的解离度。

1.2.3 单一酶水解贝肉蛋白质 根据1.2.2筛选出的枯草杆菌蛋白酶做单一酶解试验，通过单因素试验和响应面法对水解条件进行优化。

在单因素试验的基础上，以水解温度、pH值、加酶量、液固比和水解时间为考查对象，以马氏珠母贝肉水解液的镉解离度为响应指标，利用中心组合设计（central composite design，CCD）方法进行编码及响应面试验，Design－Expert 8.0软件对试验数据进行统计分析，以获得枯草杆菌蛋白酶对马氏珠母贝肉蛋白质水解的最佳水解参数。

1.2.4 双酶复合水解贝肉蛋白质

（1）复合酶组合比例的选择：按酶活比例分别为4∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4将枯草杆菌蛋白酶和胰蛋白酶混合。用复合酶对马氏珠母贝肉进行酶解，酶解条件为液固比3∶1（V∶m），水解温度50℃，水解时间6h，加酶量为4 500U／g，pH 7.5。计算镉解离度（因为主要研究对镉解离度的影响，因而选择镉解离度为指标，筛选复合酶及其比例），同时以枯草杆菌蛋白酶和胰蛋白酶的单一酶解试验结果作为对照，选择镉解离度最大的组合比例为复合酶最佳组合比例。

（2）响应面法优化双酶复合水解条件：以水解温度、加酶量和水解时间为试验因素，以镉解离度和水解得率为响应指标，利用中心组合设计方法进行编码及响应面试验，研究各因素对镉解离度和水解得率的影响，通过模型计算得到双酶复合水解马氏珠母贝肉蛋白质的最佳酶解参数，按式（2）计算镉水解得率。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶的筛选

不同蛋白酶对马氏珠母贝肉的水解效果见表1。由表1可知，枯草杆菌蛋白酶的镉解离度最高，解离效果最好，是胰蛋白酶次之，因此选择枯草杆菌蛋白酶为马氏珠母贝肉酶法解离镉的最适蛋白酶。

2.2 枯草杆菌蛋白酶水解贝肉对镉解离度的影响

2.2.1 试验模型建立和方差分析 由2.1蛋白酶筛选的结果可知，枯草杆菌蛋白酶最适于解离马氏珠母贝肉中的镉，因此对其进一步进行条件优化。在单因素试验基础上，以贝肉水解液的镉解离率为试验指标，设计5因素3水平的响应面试验，试验因素和水平表见表2，试验设计和结果见表3。

表1 不同蛋白酶对马氏珠母贝肉的水解效果Table 1 Hydrolysates of Pinctada martensii meat by different protease

表2 枯草杆菌蛋白酶单一水解试验因素和水平表Table 2 Factors and levels central composite design hydrolysis by subtilisin

表3 枯草杆菌蛋白酶单一水解试验设计方案和结果†Table 3 Central composite design and results of hydrolysis by subtilisin

续表3

用Design－Expert软件以响应面法中心组合设计原理建立酶解试验方案，并进行试验，在因素方差分析中，剔除AB、AE、A2等不显著的交互因素，得到5因素与镉解离度 （Y）之间的回归模型：Y ＝66.16＋4.23A＋4.82B＋4.35C＋9.93 D－4.81E－3.48AD－4.32CD－4.91B2－4.89C2－9.77E2，剔除不显著交互因素的方差检验见表4。

表4 因素方差分析Table 4 Variance analysis of factors

图1 液固比和时间交互作用影响镉解离度的曲面图和等高线图Figure 1 Response surface plot and contour plot of the effects of Liquid to solid ratio and time on the taxol production

由表4可知，失拟项不显著（P＝0.153 6＞0.05），回归方程极显著（P＜0.000 1），说明模型拟合良好。模型的相关系数R2＝91.76%＞90%，说明模型具有良好的相关性。变异系数（CV）反映模型的置信度，CV值越低模型的置信度越高，此模型的变异系数（CV）为2.405%，说明此模型能较好的反应真实的试验值。

2.2.2 响应面交互因素作用分析和优化 图1、图2分别显示液固比和温度交互作用、添加量和液固比交互作用对镉解离度影响的趋势图，从等高线图可以直观地反映出两变量交互的显著程度，圆形表示交互作用不显著，椭圆表示显著，图1和图2等高线呈现椭圆型，表明两个图对应的交互作用均显著。

由图1、图2的响应面立体图可以看出，响应值存在最大值。通过软件分析计算，可以得到镉解离度的最大预测值为82.843 7%，水解参数条件为时间4.83h，温度64.87，添加量4 680U／g，液固比5∶1（V∶m），pH值7.56。

考虑到实际操作的方便，将水解条件修正为时间5h，温度65℃，添加量4 700U／g，液固比5∶1（V∶m），pH 值7.5。在修正条件下对试验结果进行验证实验，测得镉解离度81.869%，与预测值（82.8437%）基本吻合，表明模型是合理有效的，解离效果较优。

图2 添加量和液固比交互作用影响镉解离度的曲面图和等高线图Figure 2 Response surface plot and contour plot of the effects of amount of protease add and solid－liquid ratioon the taxol production

2.3 双酶复合水解贝肉对镉解离度的影响

2.3.1 复合酶组合比例确定 由表5可知，在胰蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶的酶活力比为3∶1时，水解得率、镉解离度均较优。因此选择胰蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶组合比例为3∶1的复合酶进行复合酶解试验。

表5 复合酶组合的水解试验结果Table 5 Complex enzyme hydrolysis of the combination of results

2.3.2 响应面（CCD）试验设计优化因素的最佳水平 以水解温度、加酶量和水解时间为影响因素，镉解离度和水解得率为响应值，根据中心组合设计（CCD）原理，得到3因素3水平的响应面试验设计方案，因素水平见表6，试验设计及其结果见表7。

表6 胰－枯复合酶水解试验因素和水平表Table 6 Factors and levels central composite design hydrolysis by mixed enzymes

复合酶和10g马氏珠母贝肉在pH值7.0，液固比4∶1（V∶m）下进行酶解试验，得到3因素与镉解离度（Y）和水解得率（Z）之间的回归模型：Y＝84.71＋7.77A＋11.85B＋6.32C－1.84AB＋13.64AC＋0.63BC－9.71A2－11.06B2－16.78C2，Z＝86.12＋1.60A－3.06B＋2.19C＋0.13AB－0.82AC－1.05BC＋0.89A2－4.69B2－0.58C2，对回归模型进行方差分析，回归模型的方差检验详见表8和9。

由表8可知，镉解离度的回归模型极显著（P＝0.000 5＜0.01），同时模型中的时间、温度、添加量和时间与添加量的交互项，以及时间、温度、添加量显著（P＜0.05）。镉解离度回归模型的方差分析失拟项不显著 （P＝0.258＞0.05），说明此模型拟合程度较好。变异系数（CV）反映模型的置信度.CV值越低模型的置信度越高，此模型的变异系数（CV）为2.87%，说明此模型能较好地反应真实的试验值。相关系数R2＝94.2%＞90%，说明模型的相关性好。因此试验模型可以有效模拟预测试验结果。

表7 复合酶解试验设计方案和结果†Table 7 Central composite design and results of enzymatic hydrolysis

表8 镉解离度的回归模型方差分析Table 8 Variance analysis of factors Cd

表9 水解得率的方差分析Table 9 Variance analysis of hydrolysis yield

由表9可知，水解得率二次回归模型极显著（P＝0.001 1＜0.01），失拟项不显著（P＝0.287 7＞0.05），说明此模型拟合程度较好。同时模型中时间、温度、添加量、温度的二次项均显著（P＜0.05）。相关系数R2＝94.72%，模型的相关性良好；此模型的变异系数（CV）为1.64%，说明此模型能较好的反应真实的试验值。因此试验模型可以有效模拟预测试验结果。

因此，模型是显著的。剔除不显著因素的影响后，得到3因素与镉的解离度（Y）和水解得率（Z）之间的回归模型：Y ＝84.71＋7.77A ＋11.85B ＋6.32C ＋13.64AC －9.71A2－11.06B2－16.78C2，Z＝86.26＋1.60A－3.06B＋2.19C－4.67B2。

2.3.3 响应面交互因素作用分析和优化 由表8和表9方差分析得知，只有时间和添加量的交互因素对镉解离度的影响是显著的，因此只分析此交互因素的影响。

图3中等高线呈现椭圆形，表示添加量与时间的交互作用是显著的；立体图可以看出，响应值存在最大值。通过软件分析计算预测最佳的酶解条件是时间5h，温度50.04℃，添加量5 687.53U／g，最佳镉解离度能达到87.685 3%，酶解得率达到89.692 8%。根据实际情况修正为时间5h，温度50℃，添加量5 700U／g，验证实验效果良好，镉解离度为85.523%，水解得率为90.93%和预测结果（89.6928%）接近。

图3 时间与添加量的交互因素影响镉解离度的曲面图和等高线图Figure 3 Response surface plot and contour plot of the effects of time and solid－liquid ratio on the taxol production

3 结论

本试验研究了单一酶解、复合酶解对贝肉中镉的解离影响，以镉解离度和水解得率为响应指标，利用响应面试验法确定了双酶复合水解马氏珠母贝肉蛋白质最佳酶解条件：枯草杆菌蛋白酶与胰蛋白酶以活力比为3∶1，酶添加量5 700U／g，液固比4∶1（V∶m），pH 值7.0，温度50℃，酶解时间5h，在此条件下水解得率为90.93%，镉解离度达到85.52%。研究结果表明试验中应用的蛋白酶均对贝肉中的镉有解离的作用，其中枯草杆菌蛋白酶的镉解离度最高，而复合酶解较单一酶酶解效果更好。

之前本课题组已经报告了有机酸在一定条件下对牡蛎匀浆液中的重金属镉具有络合提取的作用［14］，柠檬酸对马氏珠母贝匀浆液中镉的提取率达到92.2%［15］，但水解得率并不高，如马氏珠母贝肉的总氨基酸含量为13.12g／100g，柠檬酸提取液的总氨基酸含量为2.94g／100g，提取液中总氨基酸含量仅占原贝肉中的22.4%。本次报告的酶法对镉的解离度略低于柠檬酸提取法，但其蛋白质水解得率较高，提示酶解液中氨基酸等营养物质的利用价值要优于柠檬酸提取液的。用酶解法或有机酸法提取重金属镉之后，提取液中重金属镉的脱除及脱镉后提取液中营养成分的再利用有深入研究的必要。

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11 中华人民共和国卫生部.GB 5009.5——2010食品中蛋白质的测定［S］.北京：中国标准出版社，2010.

12 中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.GB／T 5009.39——2003酱油卫生标准的分析方法［S］.北京：中国标准出版社，2004.

13 中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.GB／T 5009.15——2003食品中镉的测定［S］.北京：中国标准出版社，2003.

14 吴晓萍，廖艳，章超桦，等.柠檬酸和琥珀酸提取牡蛎匀浆液中镉的研究［J］.上海海洋大学学报，2011，20（3）：462～465.

15 王涛，吴晓萍，冯沙.柠檬酸提取贝肉中镉及其提取液中氨基酸组成分析［J］.食品与机械，2012，28（4）：77～80.