水产品及螺旋藻片中微囊藻毒素检测方法研究

雷云，戴明，周鹏，郑小严，林钦，欧阳立群

（1.福建医科大学药学院药物分析系，福建福州 350004；2.福建省产品质量检验研究院国家加工食品质量监督检验中心，福建福州 350002）

水产品及螺旋藻片中微囊藻毒素检测方法研究

雷云1，戴明2，*，周鹏2，郑小严2，林钦2，欧阳立群2

（1.福建医科大学药学院药物分析系，福建福州 350004；2.福建省产品质量检验研究院国家加工食品质量监督检验中心，福建福州 350002）

摘 要：建立了超高效液相色谱-串联质谱法检测水产品及螺旋藻片中微囊藻毒素的高灵敏度色质联用快速检测方法。样品经溶剂超声提取、固相萃取净化，氮气吹至近干并定容后，通过超高效液相色谱-串联四极杆质谱仪检测。分离柱为 Waters Acquity BEH C18柱（1.7 μm，2.1 mm× 100 mm）；流动相为 0.3% 甲酸水溶液-乙腈；流速 0.4 mL/min。4种不同基质样品中有害毒素微囊藻毒素MCYST-RR和MCYST-LR的检测限分别为0.7 μg/kg和0.3 μg/kg。4种不同基质样品中微囊藻毒素的回收率为80.0%～103.6%，相对标准偏差（RSD）为2.2%～14.6%（n=5），在0.01 μg/mL～10 μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系，线性回归系数r2均大于0.999。

关键词：超高效液相色谱-串联质谱法；水产品；螺旋藻片；微囊藻毒素

微囊藻毒素（简称MCYSTs）是在蓝藻水华污染中出现频率最高、产毒量最大的一类藻类毒素，由于其生态毒理学效应，日益引起人们的关注[1]。MCYSTs是一类单环7肽，至21世纪初已确定的MCYSTs的同分异构体已达60多种，其中研究最多两种变体为MCYST-RR与MCYST-LR[2]。微囊藻毒素具有强烈的促癌作用，我国南方原发性肝癌的高发病率被认为与饮水中的藻毒素污染有关[3]。微囊藻毒素作用的靶器官是肝脏，微囊藻毒素能强烈地抑制蛋白磷酸酶的活性，导致细胞内多种蛋白质的过磷酸化，导致肝细胞的损伤[4]。微囊藻毒素的检测方法包括蛋白磷酸酶抑制分析PPIA法、ELISA法、HPLC法，前二者易出现假阳性，受其他物质干扰严重，后者样品前处理复杂、灵敏度低[5-6]。此外，近年来利用生物传感器检测微囊藻毒素的方法也不断出现，该方法具有前处离简单、灵敏度高、分析周期短等优点，但易受其他物质干扰，尤其是复杂的水产品及食品基质[7-8]。当前色谱质谱联用技术，尤其是超高效液相色谱-三重四极杆质谱具有分析速度快、定量准确的特点，日益广泛地应用于微囊藻毒素的检测[9-11]。

采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱，比较分析不同的水产品样品及螺旋藻片中微囊藻毒素的提取、净化的方法，建立了高灵敏度色质联用检测微囊藻毒素技术，为我们有效监测食品中该类污染物的污染情况提供重要的技术手段。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

MCYST-RR和MCYST-LR标准品纯度大于95%，购于TaiWan Algal Science Inc；所用试剂除特别标注外均为分析纯试剂，甲醇、乙腈为色谱纯；水为超纯水；甲酸：购自Acros公司，纯度大于99%。

1.2 仪器设备

Agilent 1290超高效液相色谱仪配Agilent 6460 QQQ串联四极杆质谱仪：美国安捷伦公司；高速冷冻离心机：美国贝克曼公司，Avanti J-E；12管固相萃取装置：美国Supelco公司；Sonics VCX130PB超声破碎仪：Sonics and Materials，Newtown，CT，USA。

1.3 试验样品

鲫鱼、虾、河蚌和螺旋藻片样品均购自市场。分别取鲫鱼、虾与河蚌肌肉组织，用清水冲去污物和泥沙，并用滤纸或者干净纱布小心的吸去多余的水分，放入搅碎机中搅碎至匀浆状；螺旋藻片样品置于碾钵中磨细，置于-20℃冷冻备用。空白样品经分析均无MCYST-RR和MCYST-LR。

1.4 样品制备

取上述样品1.0g，置于离心管中，加入10mL丁醇∶甲醇∶水（1∶4∶15，体积比）混合溶液，于 4℃下用超声破碎仪持续超声3 min，并在12 000 r/min下高速离心10 min，移取上清液至干净容器中避光保存。再次加入提取液，依上法重复提取3次，合并以上3次上清液。再于旋转蒸发仪上浓缩，蒸去甲醇后，待用。

1.5 样品净化

移取10 mL甲醇，注入HLB固相萃取小柱，使液体自然滴下，当甲醇液面接近小柱上层塞板时，加入10 mL纯水活化。将上述样品残液加入已预先活化的HLB柱中进行富集。待富集完毕，依次用20%甲醇水溶液淋洗，100%甲醇溶液洗脱。洗脱液收集于50 mL圆底烧瓶中，于旋转蒸发仪上依次蒸干，用于再次富集。吸取10 mL甲醇活化硅胶固相萃取小柱，使液体自然滴下，在活化、平衡、淋洗、洗脱过程中硅胶填料应保持润湿，不使其干涸。50 mL圆底烧瓶中样品用2 mL甲醇溶出，并移至活化好的硅胶固相萃取小柱进行富集。待富集完毕，依次用甲醇淋洗，70%甲醇洗脱。洗脱液收集于50 mL圆底烧瓶中，于旋转蒸发仪上蒸干，取下圆底烧瓶，用1 mL甲醇分3次溶解样品并转入1.5 mL离心管，放入离心浓缩仪蒸干后加入1 mL纯水溶解样品，离心取上清液用于液相色谱-串接质谱法测定。

1.6 色谱和质谱条件

1.6.1 色谱条件

仪器：Agilent 1290 UHPLC；流动相：0.3%甲酸水溶液（A）+乙腈（B）；流速：0.4 mL/min；色谱柱：Waters Acquity UPLCTMBEH C18，1.7 μm，2.1 mm×100 mm；柱温：40℃；样品盘温度：4℃；洗脱程序：等度，80%A+20%B；进样量：5 μL。

1.6.2 质谱条件

仪器：Agilent 6460型三重四极杆质谱仪；电离源模式：电喷雾离子化；电离源极性：正离子模式；雾化气：氮气 N2；雾化气压力：50 psi；毛细管电压：3 500 V；干燥气温度：325℃；干燥气流速：5 L/min；鞘气温度：380℃；鞘气流速：12 L/min；监测方式：多反应监测（MRM）；分辨率：Q1（unit）Q3（unit）。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的选择

配制 1.0 μg/mL微囊藻毒素 MCYST-RR与MCYST-LR的水溶液，分别进行进行一级全扫描与二级全扫描机多反应检测（MRM）。为了获得MCYST-RR和MCYST-LR检测的最佳质谱参数进行有效定量，我们研究了相关的质谱条件。通过优化雾化气压力、毛细管电压、干燥气温度与流速、鞘气流速等参数，从而获得有效的分子离子峰；同时还优化了碎片碰撞能（CE）、毛细管出口端输入电压（Fragmentor voltage）以获得最大的碎片离子响应。实验表明质谱多反应监测（MRM）有效克服了实际样品干扰组分较多，样品背景较脏的缺点，通过检测特定质荷比的碎片离子峰，可以获得的更高的选择性和灵敏度，实现对MCYST-RR和MCYST-LR的准确定量。并且一级正离子模式全扫描监测实验表明：MCYST-RR的电离以二价正离子为主，[M+2H]2+呈现为基峰，m/z为519.8，同时还有少量的一价正离子[M+H]+产生，m/z为1 038.6。在ESI/MS分析中，一价与二价正离子对于确定微囊藻毒素的分子量与分子结构具有重要作用。负离子检测结果表明，MCYST-RR在该实验条件下未能检测出其负分子型离子[M-H]-，m/z为1 036，其原因在于MCYST-RR在ESI/MS分析中产生的负离子较少，负离子检测不灵敏。选择m/z为519.8为MCYST-RR检测的母离子，其最主要的碎片离子峰包括：m/z 135（[C9H11O+H]+）、m/z 103（[C5H10O2+H]+）、m/z 70.1（[C4H7N+H]+）；MCYST-LR的基峰为m/z 995.5，其最主要的碎片离子峰包括：m/z 134.9 （[C9H10+H]+）、m/z 212.9 （[Glu-Mdha+H]+）、m/z 599.2（[Arg-Adda-Glu+H]+）和 m/z 977.4（[M+H-H2O]+）。MCYST-RR与MCYST-LR两种物质的子离子扫描的色谱与质谱图见图1和图2，微囊藻毒素MCYST-RR与MCYST-LR的定量和定性子离子及相应的质谱参数如表1。

图2 微囊藻毒素-RR和微囊藻毒素-LR的子离子扫描质谱图Fig.2 Product ion scan spectra for MCYST-RR与MCYST-LR

图1 微囊藻毒素-RR与微囊藻毒素-LR的子离子扫描色谱图Fig.1 Chromatogram of standard solution of MCYST-RR与MCYST-LR

表1 微囊藻毒素-RR和微囊藻毒素-LR的MS/MS参数Table 1MS/MS parameters for MCYST-RR and MCYST-LR

2.2 色谱条件的选择

在色谱分析过程中，分析柱采用Waters Acquity UPLC TM BEH C18柱，同时使用C18预柱保护分析柱。在考虑色谱柱的耐酸性能基础上，本研究试验了纯水、0.1%甲酸、0.2%甲酸、0.3%甲酸和0.4%甲酸与乙腈作为流动相的分离效果，实验发现0.3%甲酸-乙腈作为流动相时获得满意的结果。在流动相中加入适量甲酸也有利于提高MCYST-RR和MCYST-LR样品的离子化效率和检测响应灵敏度。试验中我们比较了等度洗脱和梯度洗脱两种洗脱模式，由于组织样品复杂，干扰组分较多，为了有效改善峰形，提高样品分离选择性、减少脱尾并缩短分析时间，本研究选择梯度洗脱模式，通过不断改变流动相极性，使流出组分获得合适的分离度。同时试验表明乙腈－水－甲酸体系相对于甲醇－水－甲酸体系具有更好的峰对称性、分析物选择性，获得更好的分离效果，内源性杂质不干扰样品的分析。并且本方法采用了最新的超高效液相色谱技术和1.7 μm粒径的色谱柱，具有极高的分离效率，微囊藻毒素样品在4min内即完全分离MCYST-RR和MCYST-LR的保留时间分别为2.737 min和3.323 min。

2.3 样品提取与净化条件的选择

在样品提取过程中，我们比较了不同萃取溶剂对MCYST-RR和MCYST-LR提取回收率的影响。这些萃取溶剂包括甲醇、酸化甲醇（0.05%TFA）；EDTA·Na2（0.01 mol/L）-酸化甲醇（0.05%TFA）；5%乙酸水溶液、丁醇∶甲醇∶水（1∶4∶15，体积比）混合溶液。实验表明丁醇∶甲醇∶水（1∶4∶15，体积比）混合溶液提取MCYST-RR和MCYST-LR可以得到相对较好的回收率，提取液中丁醇的加入可有效破坏目标物与肌肉组织的结合，从而提高对样品的提取回收率。而甲醇、酸化甲醇（0.05%TFA）、EDTA·Na2（0.01 mol/L）-酸化甲醇（0.05%TFA）；虽然也可有效提取目标组分，但由于甲醇尤其是酸化甲醇提取的组分更为复杂，易产生基质效应，对目标物的定量分析产出干扰。

在样品净化过程中，我们着重研究了以固相萃取为基础的样品净化方法，在本研究中我们比较了单SPE柱方法和组合SPE柱方法，在单SPE柱方法中我们分别比较了C18、硅胶柱、Oasis HLB柱。Oasis HLB型固相萃取吸附剂是由亲脂性的二乙烯基苯和亲水性的N-乙烯基吡咯烷酮两种单体共聚而成的大孔聚合物，通过调节两种单体比例可以获得两亲平衡的吸附剂。研究表明单独使用以上任一种SPE柱，均无法得到很好的净化效果，样品的电离抑制均大于50%。而就反相色谱柱而言HLB柱的样品回收率明显高于C18柱。通过组合HLB柱和硅胶柱可以有效的提高净化效率，显著的降低样品的电离抑制。

2.4 分析方法确证

2.4.1 方法的选择性

取鱼肉（虾肉、蚌肉和螺旋藻片）空白样品1.0 g，按“1.4样品制备”和“1.5样品净化”方法操作，获得空白样品的色谱图；将一定浓度的MCYST-RR和MCYST-LR添加入鱼肉（虾肉、蚌肉和螺旋藻片）样品，依同法操作，得相应的色谱图；试验结果表明在目标组分出峰时间无干扰峰存在。

图3 鱼肉空白样品与基质加标样品MRM色谱图（叠加）Fig.3MRM chromatograms of MCYST-RR and MCYST-LR in blank and spiked fish sample

2.4.2 标准曲线与检测限

配制 0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0 、10.0 μg/mL 7 个不同浓度的标准溶液，以样品峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，样品浓度比为横坐标，做出MCYSTRR和MCYST-LR的标准工作曲线，得到MCYST-RR的线性方程为 y=1 810.6x-972.26，r2=0.998 4；MCYSTLR的线性方程为y=1 296.6x+554.7，r2=0.997 8；线性范围为 0.01 μg/mL～10 μg/mL。同时分别配制 MCYST-RR和MCYST-LR的鱼肉低浓度（0.1μg/g）的质量控制样品（QC），实验计算表明，MCYST-RR的方法检测限（LOD）与方法定量限（LOQ）分别为 0.2 μg/kg与 0.7 μg/kg；MCYST-LR的LOD与LOQ分别为0.1μg/kg与0.3μg/kg。

2.4.3 提取回收率

取鱼肉、虾肉、蚌肉和螺旋藻样品低、中、高3个浓度，分别加入低、中、高3个浓度（分别为10、50、100 μg/kg），按“1.4 样品制备”和“1.5 样品净化”方法操作，每个浓度进行3个样本分析。通过比较以上处理样峰面积与标准溶液直接进样所得峰面积之比计算各浓度点得平均方法回收率，见表2。

表2 4种不同基质中微囊藻毒素-RR与微囊藻毒素-LR的样品基质加标回收率（n=5）Table 2 The recovery of MCYST-RR and MCYST-LR in different matrix（n=5）

2.4.4 方法的精密度

按“1.4样品制备”和“1.5样品净化”方法操作，分别配制MCYST-RR和MCYST-LR的鱼肉、虾肉、蚌肉和螺旋藻样品低、中、高3个浓度（分别为10、50、100 μg/g）的质量控制样品（QC），每一浓度分析 5 次，连续测定3 d。从而求得本测定方法的精密度（QC样品测定值的相对标准偏差值），见表3。

表3 4种不同基质中微囊藻毒素-RR与微囊藻毒素-LR高低浓度的日内与日间精密度Table 3 The precision of MCYST-RR and MCYST-LR in different matrix

3 结论

本研究建立了水产品及食品中微囊藻毒素含量测定的超高效液相色谱-串联质谱联用检测方法。该方法可有效满足产品质量检验部门、水产品质量检验部门对水产品及食品中微囊藻毒素的快速灵敏检测，为严格质量管理监控提供必要的技术支持，提高产品质量水平，保障人民身体健康。

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Determination of Microcystins in Aquatic Products and Spirulina Powder Ablets by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

LEI Yun1，DAI Ming2，*，ZHOU Peng2，ZHENG Xiao-yan2，LIN Qin2，OUYANG Li-qun2
（1.Department of Pharmaceutical Analysis，Faculty of Pharmacy，Fujian Medical University，Fuzhou 350004，Fujian，China；2.China National Quality Supervision and Testing Center for Processed Food，Fujian Inspection and Research Institute for Product Quality，Fuzhou 350002，Fujian，China）

Abstract：A simple and rapid method was developed for the determination of microcystin-RR and microcystin-LR in aquatic product and spirulina powder ablets by ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometric（UHPLC-MS/MS）.The analytes were extracted from aquatic products and spirulina powder ablets using butanol：methanol：water （1∶4∶15，volume ratio）with ultrasonication， followed by a solid-phase extraction （SPE）on Oasis HLB and silica cartridges.After the chromatographic separation on Waters Acquity BEH C18 （1.7 μm，2.1 mm×100 mm）column by 0.3%formic acid-acetonitrile isocratic elution， the analysis was carried out by UHPLC-MS/MS.The linear range of microcystins in aquatic products and spirulina powder ablets were 0.01 μg/mL-10 μg/mL （r2＞0.99） and the limits of detection were 0.7 μg/kg for MCYST-RR and 0.3 μg/kg for MCYST-LR.The recoveries were ranged from 80.0%-103.6% ， and the relative standard deviations were 2.2%-14.6%（n=5）.

Key words：UHPLC-MS/MS；aquatic products；spirulina powder ablets；microcystin

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.13.024

福建省自然科学基金（2009J05115&2010J05019）；福建省卫生厅基金（2010-1-34）

雷云（1982—），女（畲），讲师，博士，研究方向：药物分析化学。