长链非编码RNA H 19对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响*

章杰 李文芳 王芳 杨红华 万芸 刘伟

（南昌大学第一附属医院 江西南昌 330006）

长链非编码RNA H 19对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响*

章杰 李文芳#王芳 杨红华 万芸 刘伟

（南昌大学第一附属医院 江西南昌 330006）

目的：探讨长链非编码RNA H19在瘢痕疙瘩组织中的表达情况及对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响及机制。方法：本次实验共收集8例瘢痕疙瘩患者组织标本，对照组取自8例成熟皮肤、8例成熟瘢痕，通过RT-PCR法检测长链非编码RNA H19的表达；对体外培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞，首先采用脂质体介导的scramble siRNA、H19 siRNA、阴性对照siRNA转染体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞，验证H19 siRNA的转染效率；MTT法检测转染H19 siRNA后成纤维细胞的增殖，Westing blotting检测转染后血管内皮生长因子(vascularendothelialgrow th factor,VEGF）和雷帕霉素靶蛋白(mammalian targetof rapamycin,mTOR)的表达。结果：与对照组相比，H19mRNA的表达量在瘢痕疙瘩患者中明显升高（P<0.05）；与scramblesiRNA、阴性对照siRNA相比，转染48 h后H19 siRNA转染的成纤维细胞H19mRNA表达量明显降低（P<0.05）；与空白对照组（转染时不加siRNA和脂质体）和阴性对照组siRNA组相比，使用H19的siRNA转染后，成纤维细胞的增殖明显受到抑制，mTOR和VEGF的表达水平明显降低（P<0.05）。结论：下调非编码长链RNA H19的表达量可以抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖。

瘢痕疙瘩；长链非编码RNAH 19；增殖

#通讯作者：李文芳，E-mail：wenfanglee@126.com

瘢痕疙瘩（Keloid,KD）是特殊体质发生的一种纤维组织增生，是整形外科常见的疾病，近年大量研究结果表明瘢痕疙瘩的发病机制与多种信号转导通路、基因和细胞因子密切相关[1]。成纤维细胞是瘢痕疙瘩组织的主要效应细胞，主要病理特点是过度增生、凋亡障碍及分泌大量的细胞外基质[2]。长链非编码RNA（lncRNA）是一类长度在200～100 000 nt的RNA分子，本身不编码蛋白质，大量研究表明lncRNA参与了转录激活、转录干扰和核内运输等多种重要的调控过程[3]。长链非编码RNA H19在多种肿瘤中异常表达，且具有原癌活性，敲除H19后，肿瘤细胞的增殖及侵袭能力显著降低[4]，鉴于H19在基因表达及肿瘤方面的独特作用，有理由推测，其与瘢痕疙瘩也有着必然的联系。然而，迄今为止对于H19是否在瘢痕疙瘩组织中异常表达尚不明确，本文首先通过RT-PCR检测患者瘢痕疙瘩组织中H19的mRNA表达情况，然后通过体外培养、siRNA转染干扰技术探索H19与瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的关系。

1 材料和方法

1.1 病例收集 收集2006年5月～2013年6月在我院就诊的8例瘢痕疙瘩患者组织标本，患者术前无药物治疗史，术前均经患者知情和同意，该试验方案均经过我院伦理委员会批准，术后病理证实为瘢痕疙瘩。对照组取自8例成熟皮肤、8例成熟瘢痕，所取部位与瘢痕疙瘩基本相近。

1.2 成纤维细胞的分离、培养及分组 将切除的新鲜标本用生理盐水漂洗3次，去除上皮，切成2 mm×2mm大小的组织块，平铺在无菌培养瓶上，加入0.5m L培养液，放入37℃、5%的CO2培养箱中培养，4 h后翻转培养瓶，继续加入5m L培养液及少量血清培养。3～4 d换液一次，当培养的成纤维细胞长满瓶底后，用PBS漂洗，0.25%胰蛋白酶消化，传代，加入新鲜的培养液继续培养，取经过3次传代培养的细胞用于本实验研究。体外研究H19与增殖关系的实验设计：实验分为三组，空白组（转染时不加siRNA和脂质体）；阴性对照组（加入阴性对照siRNA与脂质体复合物）；H19 siRNA转染组（转染时加入H19 siRNA的质粒）。

1.3 脂质体介导的siRNA干扰 采用脂质体介导的scramble siRNA、H19 siRNA、阴性对照siRNA转染体外培养的成纤维细胞进行转染效率的鉴定，阴性对照siRNA与目的基因的序列无同源性，GAPDH作为内参。H19的siRNA为三种siRNA的混合物包括三种：H19-siRNA1，5’-CCAACAUCA AAGACACCAUd-TdT-3’；H19-siRNA2，5’-GCAG GACAUGACAUGGUCCdTdT-3’；和 H19-siRNA3，5’-UAAGUCAUUUGCACUGGU UdTdT-3’[5]。待细胞生长到60%～80%融合时，按scramble siRNA、H19 siRNA转染试剂的说明书进行转染。每组设8个复孔，转染后用转染试剂于37℃在培养箱培养5 h后。每孔中加入含有20%胎牛血清的DMEM培养基。37℃培养箱培养至24 h，更换为新鲜含10%血清的DMEM培养基继续培养至48 h后收集细胞进行实验。

1.4 RT-PCR检测lncRNA的mRNA表达 瘢痕疙瘩成纤维细胞转染1 d后收集细胞，按RNA分离试剂盒说明进行分析所提取总RNA，使用反转录试剂盒（Promega）进行反转录，具体操作根据说明书进行。利用琼脂糖凝胶电泳进行检测各组lncRNAH19的表达，GAPDH作为内参，定量分析各电泳条带的光密度，RT-PCR产物以各组细胞目的基因与GAPDH的光密度比值进行比较，每组样本检测8次。患者新鲜组织标本每个样取100mg进行提取mRNA，之后步骤如上。

1.5 Westing blotting检测转染后成纤维细胞VEGF和mTOR的表达 转染48 h后收集细胞，使用蛋白提取试剂盒（碧云天）提取蛋白，所有操作按照说明书进行。Bradford法定量后，进行SDS-PAGE凝胶电泳，使用湿转法转膜，封闭，一抗过夜，血管内皮生长因子 (vascular endothelial grow th factor,VEGF）、雷帕霉素靶蛋白 (mammalian target of rapamycin,m TOR)和caspase-3抗体均购自美国santa cruz公司，洗膜，HRP标记的二抗（康为世纪）室温孵育1 h，洗膜后，ECL显色。Image J软件灰度分析结果，GAPDH（santa cruz）作为内参。

1.6 MTT法检测瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖 用胰蛋白酶将处于对数生长期的成纤维细胞消化，制成细胞浓度为1×104个/m L的细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，每孔细胞悬液100μL。分别用质粒感染，每组设8个副孔，分别培养至12、24及48 h后加入MTT（5mg/m L）20μL继续培养，终止培养后，吸弃孔内上清，每孔加入150μLDMSO，震荡使晶体充分溶解，酶标仪上检测波长为490 nm的吸光值。

1.7 统计分析 数据采用SPSS19.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差(±S)表示，比较采用单因素方差分析和t检验，两两之间的比较采用LSD-t检验，P<0.05定义为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 长链非编码RNAH19在正常组织与瘢痕疙瘩组织中的表达 长链非编码RNA H19的mRNA水平在正常皮肤与成熟纤维组织中表达水平较低，而在瘢痕疙瘩组织中表达明显升高，与前两者相比有显著统计学差异（P<0.05）。见表1。

表1 三种组织中H19mRNA表达量 (±S)

表1 三种组织中H19mRNA表达量 (±S)

注：与正常皮肤、成熟瘢痕组织相比，*P<0.05。

正常皮肤组织 成熟瘢痕组织 瘢痕疙瘩组织0.21 0.11 0.09 0.14 0.23 0.22 0.15 0.23 0.1725±0.05676 0.22 0.12 0.23 0.09 0.12 0.21 0.32 0.27 0.1975±0.08067 0.86*0.75*0.65*0.14*0.96*0.75*0.34*0.79*0.6550±0.27670*

2.2 鉴定转染后干扰效率 鉴定转染后干扰效率，与 scramble siRNA、阴性对照siRNA相比，H19 siRNA转染后的成纤维细胞H19mRNA表达量明显降低，有显著统计学差异（P<0.05）。见表2。

表2 三种组织中成纤维细胞H19mRNA表达量 (±S)

表2 三种组织中成纤维细胞H19mRNA表达量 (±S)

注：与scramble siRNA、阴性对照siRNA相比，*P<0.05。

阴性对照组siRNA scramble siRNA H19 siRNA 0.42 0.60 0.70 0.63 0.64 0.32 0.85 0.86 0.6280±0.1880 0.53 0.40 0.60 0.91 0.43 0.65 0.22 0.92 0.5825±0.2440 0.01*0.05*0.09*0.06*0.01*0.02*0.03*0.01*0.0350±0.0293*

2.3 转染后成纤维细胞增殖的变化 与空白对照组相比，H19 siRNA转染后的成纤维细胞增殖在12、24和48 h内明显受抑制，统计学差异显著（P<0.05）。见表 3。

表3 转染后成纤维细胞增殖的变化 (±S)

表3 转染后成纤维细胞增殖的变化 (±S)

空白组（OD值） 质粒转染组（OD值） t P值12 h 24h 48 h 0.1982±0.0279 0.2563±0.05127 0.3143±0.0984 0.1421±0.0153 0.2015±0.0281 0.2312±0.0315 20.03 3.25 2.79＜0.01＜0.01＜0.05

2.4 转染后成纤维细胞的Stat3和mTOR的变化与空白组和阴性对照组相比，H19 siRNA转染组的VEGF和mTOR表达水平明显降低，有显著统计学差异（P<0.05）。见表 4、表 5。

表4 三种组织中VEGF表达水平 (±S)

表4 三种组织中VEGF表达水平 (±S)

注：与空白组和阴性对照组相比，*P<0.05。

空白组 阴性对照组 H19 siRNA转染组0.96 0.91 1.12 0.89 0.87 0.950±0.1007 0.87 1.13 0.86 0.92 0.89 0.934±0.1119 0.36*0.49*0.34*0.28*0.31*0.356±0.0808*

表5 三种组织中mTOR表达水平 (±S)

表5 三种组织中mTOR表达水平 (±S)

注：与空白组和阴性对照组相比，*P<0.05。

空白组 阴性对照组 H19 siRNA转染组0.72 0.61 0.49 0.69 0.54 0.610±0.09721 0.65 0.79 0.56 0.60 0.57 0.634±0.09397 0.12*0.19*0.27*0.11*0.23*0.184±0.06914*

3 讨论

本研究结果首次证实长链非编码RNA H19在瘢痕疙瘩组织中的表达异常升高，以往研究表明病理性瘢痕疙瘩的发生与多种信号转导异常有关，其中原癌基因c-Myc和转录因子E2F1在瘢痕疙瘩组织中发挥重要作用，原癌基因c-M yc与细胞增殖、分化关系密切，主要作用机制是通过编码生长因子、受体和细胞内信息传递物质调控细胞的生长增殖与分化，c-M yc蛋白的表达在疙瘩成纤维组织中明显升高[6]。最近一项研究表明c-Myc可以诱导ln RNA H19的表达[7]。E2F1蛋白在瘢痕疙瘩组织中表达水平较正常皮肤组织明显升高[8～9]，它在成纤维细胞的分化、增殖或表型转化及胶原合成中发挥重要的作用。此外，研究同时证实E2F1可以诱导H19的表达[10]。因此，我们推测瘢痕疙瘩组织中成纤维细胞可能通过c-Myc及E2F1调控H19的表达，从而在瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖中发挥重要作用。

mTOR是哺乳动物雷帕霉素的靶蛋白，P70S6k是核糖体40s小亚基S6K蛋白激酶，通过磷酸化S6蛋白激酶5’TOPmRNA的翻译起始，5’TOPmRNA翻译的产物控制包括大部分的翻译元件成分，而翻译元件在有丝分裂原刺激引起的细胞生长、增殖过程中发挥关键的作用[11]。抑制m TOR活性可以使下游的P70S6K和4E-BP1磷酸化受阻，阻止真核起始因子eIF-4E的释放和转录，抑制细胞生长增殖。研究证实mTOR/P70S6k信号途径是瘢痕疙瘩发病机制中的重要参与者，抑制m TOR的活性可以抑制疙瘩成纤维细胞的增殖[12]。本研究发现下调H19基因可以明显降低m TOR的表达量，提示H19可能通过m TOR信号通路控制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖。血管内皮生长因子（VEGF）是新生血管形成中重要的血管内皮细胞刺激因子[13]，在正常人体内分布广泛，生理情况下表达水平较低，在一些病理情况下如肿瘤组织中过量表达，主要作用是促进血管生成增加血供以及促进损伤组织和血管内皮细胞的修复。VEGF过表达是瘢痕疙瘩形成及发展的重要因素[14～15]，抑制瘢痕疙瘩中VEGF的产生可以减少新生血管的数量，从而显著抑制瘢痕疙瘩的生长[16]。以往研究证实VEGF在疙瘩组织中的全层均有表达，但主要由角朊细胞和成纤维细胞产生。本研究发现降低H19的表达量可以显著抑制VEGF的生成，从而抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖，表明H19是成纤维细胞生成VEGF的重要调节因子。

综上所述，H19的过量表达与瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖密切相关，下调H19的表达可以抑制m TOR和VEGF的产生，从而抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖，提示H19可以作为瘢痕疙瘩治疗的一个新靶点。

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Objective:To investigate the effectof long non-coding RNA H19 on proliferation of human keloid fibroblasts and the possible role of themechanisms underlying keratinocyte proliferation.Methods:The sampleswere collected from 24 patients,in which were 8 w ith keliods,8 with normal scars and 8 w ith normal skin control.The H19 expression level in human keloid fibroblasts,normal scars and normal skin were determ ined by RT-PCR.H19-siRNA,scramble siRNA and control siRNA mediated by lipfectam in were introduced into human keloid fibroblasts,respectively.The silencing effect of H19 was verified by RT-PCR.An effect of H19 on cell proliferation was investigated by MTT colorimetric assay.To evaluate which signaling mediators were regulated by H19 in keloid fibroblast,the expression ofmammalian target of rapamycin(m TOR)and vascular endothelial grow th factor(VEGF)were tested by western blot.Results:The data showed that H19 levels were markedly increased in human keloids?broblasts compared with normal controls（P<0.05）.Forty-eighthoursafter transfection,mRNA expression of H19 in H19 siRNA treated cellswas remarkedly reduced as compared with those in the scramble siRNA and control siRNA treated cells(P<0.05).H19 siRNA treatment obviously inhibit the proliferation of Keloid Fibroblasts(P<0.05).The study further veri?ed that H19 was associated w ith m TOR and VEGF,and that this association resulted in the proliferation of human keloids?broblasts.Conclusion:These data suggest that down-regulating the expression ofH19 strongly suppressed cellproliferation ofkeloid fibroblasts.

Keloid;IncRNA H19;Proliferation

江西省教育厅科学技术研究项目资助（编号GJJ13153）

R 622

B

10.3969/j.issn.1671-4040.2013.09.001

2013-10-08）